啮齿动物的立体定位手术

Neuroscience

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Summary

立体定向(或立体)手术是一种用来操作活体动物大脑的方法。该技术使得研究人员能够通过使用立体定位图谱准确地定位大脑内的深层结构。立体定位图谱提供了每个脑区相对于颅骨上的解剖学标志的三维坐标。将颅骨暴露后,麻醉的动物被固定在被称为立体定位仪的专门仪器上,该仪器能使实验工具精确放置在定好的坐标上。立体定位手术是一项用途广泛的技术,可用来产生损伤,操纵基因表达,或将实验试剂施加到大脑里。

本视频文章概述了立体定位手术的原理,包括使用立体定位图谱和立体定位仪的说明,并介绍了读取测量探头移动的游标刻度的方法。随后的讨论概括了手术过程所需的步骤。最后,展示了该技术的广泛应用,如插入电极探针以测量大脑活动以及脑组织的遗传操作方法。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 啮齿动物的立体定位手术. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

立体定位手术是一种用来操作活体动物大脑的功能强大的技术。定位处于完整大脑深处的目标区域有一个特别的难题,就是无法通过视觉来定位手术的目标。立体定向或立体定位手术是设计用来定位大脑中的分散区域,它通过利用这些区域与可见的解剖标志之间已知的空间关系。运用三维坐标系统,实验工具可被引导到特定的位置,以便测量大脑活动,产生损伤,或进行遗传操作。本短片将涉及立体定位手术的原理,演示手术过程的基本步骤,并讨论该技术的各种应用。

在讨论手术过程的细节前,让我们回顾一下该技术的基本原理和工具。首先,立体定位取决于将大脑的目标区域定位在三维坐标轴上。因此会使用到立体定位图谱。该图谱是通过三维重建大脑染色的连续切片而获得的。

在这个参照框中,空间关系用3个轴来表示:前-后轴,内-外轴和背-腹轴。如要确定感兴趣区域的位置,先在图谱中找到适当的大脑区域,再使用网格来计算相应的内外和背腹坐标。前 - 后坐标可在该页面的底部或顶部找到。该坐标是对应颅骨上的标志测量得到的,这些标志由骨板的交接,也就是缝合线形成。最突出的标志,前囟,被定义为矢状缝与冠状缝的交点。被称作拉姆达点的标志更靠后,处于矢状缝和人字缝的交叉点。

在手术过程中精确定位所计算的位置,要使用到一个被称为立体定位仪的设备。它由主基座,显微操作器,及探针夹持器组成,后者与固定夹连接在一起。门齿固定器和耳棒与动物接触,用来将其脑袋保持在固定的位置上。显微操作器用于将外科探针精确移动到大脑内的预定坐标,并配有滑动游标卡尺用以在三个方向进行精确的距离测量。

要读取游标的刻度,首先要确定0线相对于标尺右侧刻度线的位置。标尺这一侧的刻度是以10毫米来递增标记的,因此1其实是10,2其实是2 0。在这里零标记的位置显示的读数是在10和11毫米之间。要确定小数点右边的第一个数字,我们要在左边刻度上找到一条与右侧标记线吻合最好的线。然后使用左边的刻度来确定该标线的数值,这里是9,因此最后的读数为10.9毫米。

您现在已经熟悉了立体定位的基本原理,让我们来回顾一下手术过程是如何进行的。手术前,先将麻醉动物的头皮剃光毛发并消毒。为了让动物固定在立体定位仪上,将耳棒轻轻放置在动物的耳朵内,并将其门齿放到门齿固定器上。涂上眼膏,以防止在手术过程中角膜干燥。

为暴露颅骨,先用手术刀切开一个小切口。轻轻将肌肉组织分开并清洁颅骨的表面上。然后使用显微操作器将探针下降到前囟门并记录其背腹坐标。将探针抬起,移动到拉姆达处重复此步骤。如果在拉姆达处的测量和背腹前囟门处的测量小于0.1毫米,头骨被认为是水平的,您可以继续下一步。如果不是,需要抬高或降低门齿固定器,并重复测量。

现在,大脑处于水平了,让我们回到前囟门并记录内 - 外和前 - 后的坐标。根据目标坐标在脑图谱上的位置,计算出到达该位点所需做的移动并将探针移动到目标位置。在颅骨上标记该位置,用颅钻小心地在上面打个洞。就在颅骨的下面,您会发现硬脑膜,它是一层厚厚的结实的膜,可以用一个小针尖将其轻轻切开。

接着,将显微操作器杆臂放置到位,降低探头到目标的背腹坐标,在该点上进行所需的操作。

现在您了解了手术过程的基本步骤,让我们来看看神经科学家利用立体定位手术来回答实验问题的一些方法。

首先,立体定位对施加实验试剂到精确的大脑区域十分有用。这些试剂可能包含用于观察神经元投射和连接的示踪染料,化学化合物或用于神经元遗传操作的试剂。例如,注射遗传工程操作了的病毒,会在感染细胞中引入感兴趣的基因。这里,在海马体中注射一种病毒,导致了GFP在一小群神经元中表达。另一方面,用病毒导入小干扰RNA可以抑制目的蛋白质的表达。

在这个例子中,立体定位注射至侧脑室后,蛋白SOD1的表达在不同脑区都受到了抑制。

另外,立体定位手术可用于在大脑中放置电极以记录伴随神经活动的电信号。当动物经历外科手术得到恢复后,可以将电极连接至电生理记录系统,观察神经元在小鼠自由活动时的放电。

除了测量神经元的活动,立体定向手术也有助于微透析。这种技术使得能持续监测清醒动物脑组织中的药物,神经递质或代谢物浓度。要做到这一点,一个小的,充满液体,尖端含有半透膜的探针被植入到一个特定的大脑区域。小分子溶质,包括神经递质,激素和药物可扩散进探针,在那里它们可被收集用于分析。这个实验中测量了海马体中葡萄糖的浓度,它指示了大鼠完成一个需要用到空间工作记忆的任务时一个区域神经的活动。

您刚刚观看的是JoVE关于立体定位手术的视频。本短片中,我们介绍了该手术的原则和步骤方法,以及它在神经科学实验室中的许多应用。感谢观看!

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