细胞周期分析

Cell Biology

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Summary

细胞周期是指的通过该细胞生长、 复制它的基因组,和最终分为两个子细胞的有丝分裂过程的事件的集合。因为细胞中 DNA 的量显示特征变化的整个周期,称为细胞周期分析可以用于分离细胞细胞周期的不同阶段,他们是在利用人口的技术,基于他们不同的 DNA 含量。

这个视频将涵盖通过 DNA 染色的细胞周期分析背后的原则。我们会检讨执行这种着色使用广义的协议脱氧 (BrdU,胸苷模拟,纳入新合成的 DNA 链) 和碘化丙啶 (PI,污渍所有 DNA DNA 染料),其次是被染色的细胞流式细胞术分析。在流式细胞仪,荧光标记的细胞单细胞悬液通过用一束激光仪器和读取每个细胞的荧光。我们将然后讨论如何解释来自流流式细胞仪散点图的数据,最后,看看几种应用这种技术。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. 细胞周期分析. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

细胞周期是指套内导致它的分裂细胞发生的细胞和生化过程。细胞通过周期的不同阶段,要完成此过程所需的时间几乎是不变的单元格类型。任何偏离此持续时间是指示性的异常细胞分裂。因此,细胞周期分析为生物学家感兴趣的细胞分裂,最终将帮助治疗病人的疾病,如癌症,细胞周期中断机制研究成为一个非常有用的工具。

这个视频将讨论的原理和细胞周期分析广义的协议。最后,我们将展示一些应用程序这个常用的方法。

让我们学习什么细胞周期的分析是,和这种测定方法的工作原理。

从根本上说,细胞周期分析的混合人口告诉我们多少细胞中的每个不同的阶段。这通常是通过评价细胞的 DNA 含量。你可能会想: 为什么 DNA 含量吗?要理解这一点,让我们简要回顾一下染色体 DNA 通过循环细胞随着会发生什么。

在 G1 期,期间在细胞内的 DNA 含量不变。通过 S 期,DNA 复制发生,和年底这个阶段 DNA 含量增加一倍。在 G2 期细胞检查在 DNA 复制,有没有错误,最后 — — M 阶段末尾 — — 这种 DNA 获取同样分为两个子细胞。因此,标记 DNA 可以帮助科学家确定细胞周期的阶段。

这种标签的一个重要的考虑因素是 DNA 结合染料的选择。脱氧或 BrdU,是一种核酸模拟,结构上模仿胸苷。这允许 BrdU DNA 复制过程中融入越来越多的钢绞线。因此,这种染料标签只 S 期细胞。之后 BrdU 纳入 DNA 链分开的和 BrdU 检测荧光标记抗体的帮助。

其他化合物,如碘化丙啶或 PI,是固有荧光,蛭石之间双链核酸,和因此染色细胞所有阶段。然而,PI 染色量 DNA 数量成正比。

虽然污渍的选择取决于手头的实验,研究人员经常使用双重染色程序。分子像按比例将绑定到的所有单元格的 PI 可以很容易区分 G2 G1 细胞或 M 期细胞。不过,S 期细胞仍处于转型期。因此,分子另外喜欢 BrdU 只有标签 S 期细胞增加细胞周期阶段检测的特异性。最后,分析了使用流式细胞仪进行细胞周期不同阶段枚举细胞的细胞。

现在,您了解细胞周期染色背后的原则,让我们讨论使用 BrdU 和 PI 程序。

建立了细胞培养皿: 一个用于实验和作为控件附加三。在 60%左右融合,BrdU 溶解在培养基中添加到活细胞,其次是孵化。在这个阶段,BrdU 纳入了复制 DNA。

后孵化,细胞离心分离,再在磷酸盐缓冲液或 PBS 悬浮。接下来,由添加细胞悬液滴到冰冷的 70%乙醇,同时旋涡轻轻固定细胞。这停止细胞分裂,防止结块。

固定的细胞是再次离心分离和再悬浮在 PBS 中。然后,含有去污剂,如特里顿-X,浓酸溶液滴补充到细胞中。洗涤剂 permeabilizes 细胞允许入境的膜不透水的化合物,和酸降低 ph 值和变性 DNA,暴露 BrdU。细胞然后离心分离上, 清液被丢弃,和颗粒再悬浮在碱性溶液中还原 ph 值。

最后,用 PBS 洗细胞并孵化与共轭到室温的荧光标记 BrdU 抗体。在这一步之后, 样品应保护从灯,避免光漂白。

当双重染色,细胞孵育 PI 和核糖核酸酶活性。核糖核酸酶有必要消除 RNA RNA 或 RNA 与 DNA 的双链,其中也将绑定到 PI 和可产生假阳性的结果。细胞然后通过细胞过滤器使单细胞悬液,是流式细胞术分析的必要条件。

既然你已经学会了染色的议定书 》,让我们检讨如何分析获得的数据。

简单地说,在流流式细胞仪检测激光束照在单细胞悬液,窄流和染料在每个单元格的特定波长发射被检测到一个散点图的单一事件。

在这里,散点图的 PI 染色细胞显示两个独特的群体,几乎两倍的 PI 比另一个。经过优化的 PI 探测器,这些集显示为在直方图分析的两个高峰。在更大的 PI 强度峰值表示 G2/M 期细胞,一个在低强度表示 g1 期细胞。这些山峰下的地区代表的相应阶段细胞数目。

同样,BrdU FITC 事件可以显示在对数刻度直方图分析。这张图显示 BrdU 阳性细胞明显聪明比污泥而不染的细胞,而且因为只有一小部分的人口是在 S 期,BrdU 较大峰值不染色的细胞可见一斑。

细胞用 BrdU 和 PI 染色散点图可以显示 PI 线性的 x 轴上与 BrdU 在对数 y 轴上,,这将显示从 g1 期,S,去 G2 马蹄模式。在封闭地区的细胞的比例可确定和条形图上显示。

现在,我们已经通过细胞周期分析的基本协议,让我们看看如何可以用于各种实验设置。

A.通过结合遗传操作与细胞周期的分析,科学家们研究特定蛋白在细胞周期进程中的角色。在此研究中,科学家组织中高表达一种叫做 p27 在小鼠胚胎成纤维细胞蛋白质。结果表明,过度表达导致降低细胞数目在 S 期,说明这种蛋白质在细胞周期调控中的重要作用。

通过细胞周期分析,科学家们可以比较进展动力学。在这里,比较了两种结直肠癌细胞株和乳腺癌细胞系之间的进展动力学。结果表明,乳腺癌细胞进步通过细胞周期相比结直肠癌细胞系中,随着时间的推移给乳腺癌细胞 G1 中的较高百分比速度慢。

最后,体内细胞周期分析中,可以在啮齿类动物注射 BrdU 和目标单元格人口可分离的细胞周期分析。在此研究中,造血干细胞或 BrdU 造血干细胞注射的老鼠被孤立的流式细胞术分析。数据收集在 g1 期和 S 相透露造血干细胞细胞周期的不同阶段之间的分布与优势。

你刚看了朱庇特的视频对细胞周期的分析。我们已经回顾了这一过程背后的原则,详细一步一步的协议,和审查中各种实验设置如何使用这种类型的分析。一如既往,感谢您收看 !

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