Ensayo de invasión utilizando Matrices 3D

Cell Biology

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Summary

La matriz extracelular (ECM) es una red de moléculas que proporcionan un marco estructural para las células y los tejidos y ayuda a facilitar la comunicación intercelular. Han desarrollado técnicas de cultivo celular tridimensional para modelar con mayor precisión este entorno extracelular para estudio en vitro . Mientras que muchos procesos de la célula durante la migración a través de matrices de 3D son similares a los requeridos para el movimiento a través de superficies 2D rígidas, incluyendo la adherencia, migración a través de ECM también requiere las células modulan e invadir esta malla polimérica de ECM.

En este video, presentamos la estructura y función del ECM y los mecanismos básicos de cómo las células migran a través de él. A continuación, examinaremos el protocolo de un ensayo para la formación del tubo por las células endoteliales, cuyos pasos se pueden generalizar a otros experimentos basados en matrices de 3D. Vamos a acabar explorando varias otras cuestiones biológicas que pueden abordarse usando análisis de invasión de ECM.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología celular. Ensayo de invasión utilizando Matrices 3D. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Los científicos han desarrollado modelos 3D para mayor precisión estudio invasión y migración de procesos de la célula. Mientras que los más tradicionales sistemas de cultivo celular son 2D, las células en nuestros tejidos existen dentro de una red 3D de moléculas conocido como la matriz extracelular o ECM. Mientras que muchos de los procesos mecanicistas para motilidad celular en 2D y 3D son similares, factores como la rigidez reducida de ECM en comparación con las superficies de plástico, la adición de una tercera dimensión para la migración y el impedimento físico de movimiento a través de la malla de polímeros largos en el ECM, todos presentan desafíos diferentes a la célula frente a la migración de dos dimensiones.

Este video introducirá brevemente la función básica y la estructura del ECM, así como los mecanismos por el cual las células modulan y migran a través de él. A continuación, analizaremos un protocolo general utilizado para estudiar la invasión de células endoteliales. Por último, destacamos varias aplicaciones de matrices 3D al estudio de cuestiones biológicas diferentes.

Empecemos por examinar la composición del ECM, y cómo las células interactúan con él.

El ECM realiza muchas funciones, como apoyo para las células, facilitando la comunicación intercelular y separando los tejidos. Composición de ECM varía entre diferentes tejidos y tiene propiedades biológicas diferentes, pero pueden clasificarse en dos tipos generales. La membrana basal sirve para anclar y separar los tejidos, mientras que la matriz intersticial rodea y soporta las células dentro de un tejido. La matriz intersticial sobre todo se compone del colágeno proteína fibrosa, pero también incluye elastina y fibronectina.

Varios procesos biológicos deban ocurrir para que las células migran a través del ECM. La primera es la adherencia de la célula-matriz, que consiste en proteínas de transmembranales llamadas integrinas. Estos link del ECM a andamio interno de la célula, conocido como citoesqueleto.

Otro proceso es el cambio estructural del citoesqueleto de la célula. Esto conduce a la formación de estructuras especializadas llamadas invadopodios, que son protrusiones de la célula en la matriz circundante. El paso final es la modulación de la ECM. Normalmente se trata de moléculas de degradación conocidas como metaloproteasas de matriz o MMP, que se acumula en el invadopodios y degrada el ECM circundante, facilitar la invasión celular. Ensayos de invasión de matriz 3D permiten a los científicos a visualizar y estudiar este proceso complejo.

Ahora que estás familiarizado con ECM y su interacción con las células, vamos a caminar a través de un protocolo para el estudio de la invasión de ECM por las células endoteliales a los túbulos de forma. Por cultivo de células endoteliales en un entorno 3D, uno puede simular el proceso biológico de crecimiento de vasos sanguíneos, también conocido como angiogénesis, que es importante durante el desarrollo normal, así como el cáncer.

Se cultivan las células endoteliales, primeras, y una suspensión unicelular es preparada tratando las células con las proteasas como la tripsina, y pasando a través de un filtro de malla para dispersar los grumos de la célula. La matriz 3D, comúnmente compuesto por colágeno, fibrina, laminina o combinaciones más complejas de estos componentes, que puede ser preparado en el laboratorio o pedir a través de proveedores comerciales, entonces se descongele el hielo. Puesto que más preparaciones ECM polimerizan a altas temperaturas, es útil mantener a otro equipo y reactivos fríos así. La suspensión de células se mezcla con la solución matriz descongeladas para incorporar las células, y esta mezcla se coloca en una incubadora de cultivo celular donde la temperatura más alta hará que la matriz polimerizar.

Una vez establecida la matriz que contiene células, medios de cultivo que contienen factores angiogénicos se agrega al plato de la matriz. Usando el software Time-lapse de la microscopia, células individuales entonces pueden ser rastreadas para observar su migración a través de la matriz. Las imágenes resultantes se analizan, y posiciones de célula se utilizan para calcular la dirección del movimiento y la distancia en micrones. Estos valores se pueden entonces trazar para determinar actividad locomotor — la tasa promedio de migración de las células. Finalmente, tubo red formación se observa y analiza utilizando el software de visualización para identificar características tales como nodos, tubos y lazos.

Ahora, vamos a explorar algunas aplicaciones de matrices 3D en experimentos específicos.

Migración de la célula es mediada por la modulación activa del citoesqueleto celular. En este experimento, matrices de colágeno fueron preparados y mezclados con un colorante que contiene proteína fluorescente roja para permitir la visualización. Esferoides celulares individuales, que son racimos de célula flotante, fueron aislados y embebidas en la matriz de colágeno. Tras incubación, las células incrustadas fueron manchadas para determinados componentes citoesqueléticos y reflejadas por microscopía de fluorescencia. Los investigadores observaron componentes citoesqueléticos y sus alteraciones, como las células migran a través del ECM.

Los científicos también pueden estudiar cómo afectan las propiedades de la ECM a migración. Utiliza un sistema de gel concéntrico, donde las células están incrustadas en una matriz de gel interno rodeada por matrices externos de diversas concentraciones, los científicos pueden seguir células utilizando microscopía de lapso de tiempo para estudiar la migración del gel interno el gel externo inicialmente libres de células. Los investigadores observaron que la mayor rigidez del gel de concentración más alto resultó en un aumento en el desplazamiento de la célula y la distancia total de migración de la célula.

Finalmente, se pueden realizar ensayos de invasión de matriz dentro de un animal vivo para estudiar la angiogenesis en un contexto de órgano-específicas. Aquí, geles de fibrina, comúnmente utilizado en ingeniería del tejido fino debido a su naturaleza biodegradable, fueron generados, seguido por la implantación en los pulmones de ratón donde los geles se llevaron a cabo en lugar por un "pegamento" del fibrinógeno proteína. Migración celular y formación de vasos sanguíneos nuevos podían ocurrir por los siguientes 7 a 30 días, después de que los pulmones y los geles de fibrina se cosecharon, fijado y seccionado. Proyección de imagen de estas secciones reveló vasos sanguíneos y la formación de alvéolos en los geles implantados, dando a los investigadores penetración en este aspecto crucial del desarrollo pulmonar en su escenario en vivo .

Sólo ha visto video de Zeus en ensayos de invasión de la matriz extracelular. Este video discute la composición del ECM y cómo células migran a través de ella, presenta un protocolo simple para estudiar la migración de células endoteliales a través de una matriz 3D y destacó varios procesos celulares, actualmente en estudio en el contexto de las interacciones célula-ECM. Porque migración celular endógeno se produce en el espacio 3D, estas condiciones biológicas se simulan mejor por técnicas de cultivo 3D. Mejoras en la composición de la matriz seguirá permiten a los científicos replicar de forma más precisa y estudiar la migración celular en el laboratorio. ¡Como siempre, gracias por ver!

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