El ensayo de bioluminiscencia de ATP

Cell Biology

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Summary

En luciérnagas, la enzima luciferase convierte un compuesto llamado luciferin en oxyluciferin y produce como resultado la luz o "luminiscencia". Esta reacción requiere energía derivada del ATP para proceder, por lo que los investigadores han aprovechado de la interacción de luciferin luciferasa para medir los niveles de ATP en las células. Dado el papel del ATP como moneda de la célula de energía, el ensayo de bioluminiscencia de ATP puede proporcionar la penetración en el metabolismo celular y la salud general de la célula.

En este video, Zeus habla sobre respiración celular, específicamente revisar cómo el metabolismo de la glucosa resulta en la producción de ATP. Esto es seguido por los principios de la prueba de bioluminiscencia de ATP y un protocolo generalizado de esta técnica. Por último, un estudio de cómo los investigadores actualmente están usando el ensayo de bioluminiscencia de ATP para evaluar viabilidad celular en una variedad de condiciones experimentales.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología celular. El ensayo de bioluminiscencia de ATP. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

El ensayo de bioluminiscencia de ATP es una técnica común utilizada para cuantificar los niveles de ATP y detectar las células vivas, metabólicamente activas. ATP o trifosfato de adenosina es la principal fuente de energía para todos los organismos vivos, y por "todos" nos referimos a todos. A nivel celular, se genera ATP a través de un conjunto de procesos metabólicos que se llama respiración celular.

Hoy, analizaremos brevemente las vías implicadas en la respiración celular. A continuación, a introducir los principios de la prueba de bioluminiscencia de ATP y pasar por un protocolo paso a paso para realizar este método. Por último, veremos cómo los científicos están aplicando esta técnica en su investigación actual.

Permite comenzar con la introducción de la respiración celular. Este fenómeno implica varios procesos metabólicos, pero nos centraremos en la que uno trata de metabolismo de la glucosa.

En el citoplasma, la vía de glucólisis convierte la glucosa en piruvato y en el proceso genera dos moléculas de ATP. Piruvato es transportado a la mitocondria, donde se convierte en acetil coenzima A, un proceso que también se genera dióxido de carbono. Mientras que en la mitocondria, acetil-coenzima A entonces entra el ácido tricarboxílico o ciclo TCA, durante el cual otra vez se genera dióxido de carbono, como son las moléculas de alta energía del NADH y FADH2. Estas moléculas, en definitiva, "llevan" electrones en la cadena de transporte de electrones o ETC.

Dentro de lo etc., los electrones son transferidos secuencialmente entre complejos de diferentes proteínas en la membrana mitocondrial interna, antes de convertir el oxígeno al agua. Durante este proceso, los protones son "bombeados" en el espacio del intermembrane de mitocondrias. ATP se produce realmente cuando estos protones hacia la matriz mitocondrial a medida que pasan a través de una proteína llamada sintasa de ATP. Juntos, el ciclo TCA y etc. como resultado la síntesis de 36 moléculas de ATP. Degradación de otras moléculas nutrientes, como grasas y proteínas, puede también alimentar en el ciclo TCA y ETC, llevando a producción de ATP.

Ahora que sabemos cómo las células generan ATP, vamos a aprender acerca de los principios detrás del ensayo de bioluminiscencia de ATP, que se utiliza comúnmente para medir los niveles intracelulares de esta molécula.

Estructuralmente, la ATP tiene una base de adenina, un azúcar ribosa y tres grupos fosfato, el último de los cuales está conectado por enlaces de alta energía. Estos bonos de liberan energía cuando se rompen, y el ensayo de bioluminiscencia de ATP aprovecha esta energía.

Básicamente, este análisis requiere el luciferin compuesto, que se obtiene de "brillantes" organismos como luciérnagas, y su correspondiente enzima catalizador llamada luciferasa. En presencia de oxígeno, luciferasa deriva energía de ATP y convierte luciferin en oxyluciferin. Subproductos de esta reacción son pirofosfato, que es dos grupos fosfato de ATP — conversión a Adenosín Monofosfato o AMP, dióxido de carbono y luz o luminiscencia. Luminiscencia es leída por un luminómetro, una máquina que cuantifica la emisión de luz. Puesto que la cantidad de luminiscencia producida es directamente proporcional a la cantidad de ATP, es un buen indicador de viabilidad celular y el metabolismo.

Ahora que usted entiende los principios de la prueba de bioluminiscencia de ATP, vamos a esbozar un protocolo general.

En primer lugar, las células se siembran en una placa de 96 pocillos que contienen medios de cultivo. Las células se platean en varias densidades por triplicado, para tener en cuenta la variación de la densidad-dependiente. Puesto que los pozos más externo no están rodeados de otros pozos en los cuatro lados, la tasa de temperatura y la evaporación en estos pozos puede ser variable. Por lo tanto, las células no se platean en los pozos de exteriores, y en cambio están llenas de agua para evitar la variación todo el plato de evaporación y temperatura que puede afectar la reacción. Las placas se incuban luego durante la noche a 37° C para permitir que las células se adhieren a las placas de cultura.

Luego, que se quita los medios de comunicación, luciferasa y luciferin se añaden a cada pocillo y la placa se coloca en un agitador durante 5-15 minutos para facilitar la reacción. A continuación, una porción de la mezcla de cada pozo se transfiere a una placa de 96 pocillos blanca; a menudo se utilizan placas blancas reflejan la luz hacia arriba, lo que permite una lectura más precisa de la luminescencia. Además, las burbujas deben evitarse, pues puede interferir con los análisis posteriores. Como la señal de luminiscencia puede disminuir con el tiempo, la placa se lee dentro de 10-12 minutos en un luminómetro.

Para analizar los resultados de luminómetro, se calcula un valor promedio de la luminescencia de pozos con la misma densidad de la célula. Comparando los datos de luminosidad obtenidos de esta manera las muestras sanas de control y células tratadas, los investigadores pueden evaluar los efectos de un tratamiento específico sobre la viabilidad y el metabolismo, específicamente mediante la detección de luminiscencia disminuida en el grupo experimental.

Ahora que has visto cómo realizar un ensayo de bioluminiscencia de ATP, vamos a discutir sus aplicaciones de la investigación.

Los científicos siempre están tratando de desarrollar nuevos antivirales que no dañar o matar las células del huésped. En este estudio, las células mamíferas se siembran en una placa de pocillos e infectadas con un virus específico. Varios compuestos antivirales fueron agregados a estas muestras, y se generaron curvas de concentración-respuesta de registro para calcular la concentración efectiva 50 o CE50. EC50 es la concentración del compuesto en el que la célula viabilidad es 50 por ciento. Este es un parámetro utilizado para evaluar la citotoxicidad del compuesto.

Niveles de ATP también pueden producir pistas acerca de la actividad mitocondrial en diversas condiciones. Aquí, el ensayo de bioluminiscencia de ATP se realizó sobre los preparativos de la mitocondria derivado de hígado de roedor y las células musculares, que ayudó a los investigadores a evaluar el alcance de la función mitocondrial en los tejidos normales. Lo importante, este protocolo podría ampliarse para proporcionar una manera de examinar la función mitocondrial en Estados de enfermedad.

Los científicos también están utilizando este análisis para investigar posibles tratamientos contra el cáncer en sistemas in vivo . En este ejemplo, las células humanas del tumor fueron modificadas para luciferase expresa e inyectadas en los cerebros de ratones vivos. Después de que las células del tumor se establecieron en estos animales, fueron tratados con un fármaco contra el cáncer. Un análisis posterior en vivo ATP bioluminiscencia reveló que las células tumorales en ratones expuestos a drogas tenían niveles más bajos de ATP.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para el ensayo de bioluminiscencia de ATP. Ahora debe estar familiarizado con las vías de respiración celular y el protocolo utilizado para medir el ATP, que es el producto final de estas vías. El ensayo de bioluminiscencia de ATP sirve como una herramienta de proyección excelente para los biólogos celulares interesado en estudiar el efecto de factores fisiológicos y patológicos en el metabolismo celular y la viabilidad. ¡Como siempre, gracias por ver!

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