タンパク質の結晶化

Biochemistry

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Summary

タンパク結晶、生体分子の固体格子を取得はタンパク質の構造を解明し、タンパク質の機能の研究ができます。結晶化は、pH、温度、イオン強度、および蛋白質の集中を含む多くの要因の組み合わせで浄化された蛋白質を乾燥を伴います。結晶を取得すると、蛋白質の構造、x 線回折法と電子密度モデルの計算によって解明されうる。

このビデオは、タンパク質の結晶化を紹介し、一般的な手順を示しています。タンパク質の発現と精製、結晶化、x 線回折の手順で覆われています。タンパク質の結晶化のアプリケーションには、膜タンパク質の構造解析、サイト裁決、インシリコ創が含まれます。

タンパク質の結晶化、蛋白質の格子状固体のフォームを取得するプロセスです。これらの結晶は、構造生物学、タンパク質機能の研究を支援する特に貴重です。量産仕様や SDS ページなどの他の技術だけ蛋白質の一次元構造の情報を提供できます。組換え蛋白質の表現の x 線回折法によるタンパク質の結晶化、補完されます。このビデオは、生化学の分野でタンパク質の結晶化、一般的な研究室プロシージャ、およびそのアプリケーションのいくつかの原則が表示されます。

プロセスに必要な最初のステップは、通常組換え蛋白質の表現を使用して、非常に純粋な蛋白質のミリグラム量を得るすることです。興味の蛋白質に対応する遺伝子は、発現ベクターにクローン化し、発現タンパク質親和性クロマトグラフィーによる浄化を支援するポリ ヒスチジンなどの親和性タグに融合。詳細については、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのこのコレクションのビデオを参照してください。

結晶に浄化された蛋白質の形成、pH、イオン強度、鉛塩法の濃度とタンパク質、温度、および平衡の率を含む多くの要因の組み合わせによって決まります。使用される最も一般的なメソッドは蒸気拡散、2 つのカテゴリがあります: ドロップと座っているドロップをぶら下がっています。純粋な蛋白質、バッファー、および鉛塩法は、イオンを含む液滴固体をバインド水の分子、蛋白質のための水の利用を削減し、同じバッファーと鉛塩法のより高濃度混合物貯留層で囲まれたマイクロウェルは、高蛋白質の集中を模倣しました。初めに、蛋白質および鉛塩法の濃度は、結晶化を引き起こすが低すぎます。実験の過程で、水液滴から気化で収集し、貯留層;液滴の水の量の減少により過飽和になるシステムと核形成、結晶化、続いてに発生することができます。液滴から水の純移動は平衡で、システムは、プロセスが完了するまで保持されます。

3 D 構造の視覚化、x 線回折を使用します。結晶からの x 線データを取得するには、ことがすべての角度でビームにさらされている単色 x 線ビームに置かれます。各露光量は、各スポットの回折結晶から出てくるし、検出器によって登録されているが、イメージを提供します。データは、結晶内の原子の配置のモデルを生成する結合されます。結果として得られる結晶構造 2 オングストロームの一般的な解像度と、原子の三次元配置を示しています。

タンパク質の結晶化の原理について説明しましたが、一般的なプロトコルを見てみましょう。

手順を開始するには、興味の遺伝子を含む表現のベクトルはセルに変換されます。細胞を培養し、中間ログ段階で式が IPTG 遺伝子の mRNA の転写をトリガーするなど、インデューサを追加することによって開始されます。タンパク質発現後粗材は換散バッファー中に浮遊し、遠心分離によって明らかに。

明らかにしライセートがニッケル列に読み込まれます、polyhistidine タグ付きタンパク質が他のすべての生体分子が洗い流される中列にバインドします。

純粋な蛋白質の数ミリグラムを取得すると、気相拡散による結晶化の準備が整いました。24 ウェル ハング/シッティング ドロップ トレイは、さまざまな濃度の塩化ナトリウムとナトリウム酢酸緩衝液でいっぱいです。座ってのドロップ、タンパク質と貯留層のソリューションの平等なボリューム、各井戸の上の棚の上に戻し、トレイは透明テープで覆われています。インキュベーション室に格納されます、トレイと井戸が次の日、その後、数日ごとの成長のため監視されます。

受けたことを適切な結晶 x 線回折分析の準備は完了です。結晶は、選択した方向に結晶を配置するゴニオ メーターにマウントされます。あらゆる角度で x 線回折パターンを作り出すの単色ビーム クリスタルが点灯します。ソフトウェアでは、結晶内の原子の位置を決定することで結晶内の電子密度の三次元モデルに、さまざまな方向で撮影した 2次元の画像に変換します。

今では手順を見直している、タンパク質の結晶化と別の結晶化の技術のいくつかの有用なアプリケーションを確認してみましょう。

タンパク質の結晶化は、インシリコ創薬に使えます。インフルエンザ ウイルスのポリメラーゼ基本的なタンパク質 2、哺乳類のウイルス感染症にリンクされている、三次元構造は、結晶化と x 線回折法によって決定しました。潜在的な結合部位蛋白質は、可視化、および三次元分子ドッキング プログラムを使って設計されたが、蛋白質の裂け目に挿入します。

タンパク質・ DNA 錯体の共結晶も役に立つテクニックです。DNA 結合タンパク質はさまざまな転写、DNA 重合、DNA 修復など生体機能を調節します。これらの複合体の結晶構造がタンパク質の機能、メカニズム、および特定の相互作用の性質に洞察力を提供できます。大腸菌タンパク質複製、DNA 複製の負の調節因子は hemimethylated DNA の結晶化されました。

不可欠な膜タンパク質など G 蛋白質によってつながれる受容器、または GCPRs、極表面領域融合によるタンパク質結晶の開発につながっている連絡先、結晶格子を形成するための彼らの限られた量のため結晶化が困難です。リゾチーム、GCPR、β 2 アドレナリン受容体をコードする遺伝子は、発現ベクターに挿入されました。Β2AR リゾチームの融合蛋白質の結晶化は、リゾチーム、結晶格子中のパッキング相互作用をかたちづくるために必要によって提供される、当然のことながら疎水性 β2AR 上増加細胞外親水性表面のため実現しました。

タンパク質の結晶化にゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオはその原則、一般化されたプロトコル、およびいくつかを説明したバイオメディカル分野で使用。見てくれてありがとう!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生化学の必需品. タンパク質の結晶化. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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