Foto-indotta cross-linking delle proteine non modificato (PICUP) permette la caratterizzazione della distribuzione dimensionale oligomeri in miscele proteiche metastabili. Dimostriamo applicazione di PICUP a tre peptidi rappresentante amiloidogenico il 40 – e 42-residuo forme di β-amiloide, proteina, e la calcitonina, e un peptide di controllo della crescita-fattore di rilascio dell'ormone.
L'assemblaggio delle proteine amiloidogenica in oligomeri tossici è un evento fondamentale nella patogenesi delle malattie misfolding, tra cui l'Alzheimer, il Parkinson, la corea di Huntington e le malattie, ereditarie sclerosi laterale amiotrofica, e diabete di tipo 2. A causa della natura metastabile di queste assemblee di proteine, è difficile valutare la distribuzione delle dimensioni oligomero quantitativamente con metodi classici, come l'elettroforesi, cromatografia luce, fluorescenza, o dinamico dispersione. Oligomeri di proteine amiloidogenica esistono come miscele metastabile, in cui gli oligomeri dissociano in monomeri e associare in grandi gruppi contemporaneamente. PICUP stabilizza popolazioni oligomero da covalenti cross-linking e in combinazione con metodi di frazionamento, come il sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) o la dimensione-cromatografia di esclusione (SEC), PICUP fornisce istantanee delle distribuzioni di dimensioni oligomero che esisteva prima croce -linking. Quindi, PICUP permette la visualizzazione e l'analisi quantitativa delle popolazioni di proteine metastabili e possono essere utilizzati per monitorare le relazioni di assemblaggio e decifrare tra le modifiche sequenza e oligomerizzazione<sup> 1</sup>. Meccanicisticamente, PICUP coinvolge foto-ossidazione del Ru<sup> 2 +</sup> In un (bipyridyl) tris Ru (II), complessi (RuBpy) alla Ru<sup> 3 +</sup> Per irraggiamento con luce visibile in presenza di un accettore di elettroni. Ru<sup> 3 +</sup> È un forte ossidante di un elettrone in grado di astrarre un elettrone da una molecola di proteina vicini, generando una proteina radicale<sup> 1,2</sup>. I radicali sono instabili, specie altamente reattiva e quindi scomparire rapidamente attraverso una serie di reazioni intra ed intermolecolari. Un radicale può utilizzare l'energia di un elettrone spaiato a reagire con un altro monomero proteina dimerica formando un radicale, che perde quindi un atomo di idrogeno e forma un stabile, covalentemente legato dimero. Il dimero può quindi reagire ulteriormente attraverso un meccanismo simile con monomeri e dimeri di altri per formare oligomeri di ordine superiore. Vantaggi del PICUP rispetto ad altri foto-chimiche o cross-linking metodi<sup> 3,4</sup> Sono brevi (≤ 1 s) l'esposizione a non distruttiva la luce visibile, senza bisogno di<i> Pre facto</iModifica> la stessa sequenza, e di lunghezza zero covalente cross-linking. Inoltre, consente PICUP cross-linking delle proteine all'interno di pH e temperatura, inclusi i parametri fisiologici. In questo studio dimostriamo applicazione di PICUP di cross-linking di tre proteine amiloidogenica il 40 – e 42-β-amiloide residui di proteine varianti (Aβ40 e Aβ42) e la calcitonina, e una proteina di controllo, l'ormone della crescita-releasing factor (GRF).
PICUP è stato sviluppato originariamente per studiare complessi proteici stabili 2. Il metodo è stato applicato in seguito allo studio quantitativo delle assemblee metastabili proteina amiloide, tra cui Aβ 10, prioni e le malattie associate PrP Sc 11 e α-sinucleina 12. I fattori più importanti che devono essere considerati quando si progetta un esperimento PICUP sono la stechiometria dei reagenti, tempo di irradiazione, e la preparazione procedura di esempio. I primi due problemi può richied…
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni AG027818 e AG030709 dal NIH / NIA, 2005/2E dalla L. Larry Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 dall'Associazione Alzheimer, e 07-65798 dalla California Department of Public Health.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |