Summary
この記事では、電位差色素（ジ- 8 - ANEPPS）を使用してランゲンドルフ灌流ラット心臓の表面に光学的に画像のアクション潜在的な動きに高い時間および空間分解能のテクニックを説明します。
Abstract
電位感受性蛍光色素による心臓の表面の光学的マッピングは、実験モデルでの電気的励起を調べるために重要なツールとなっているその細胞培養物からの全体の臓器へのスケールの範囲
Protocol
パート1：準備のソリューションと分離された灌流心臓システム
- 以前に[5、6]を説明するように実験の朝に、クレープス-ヘンゼライト溶液の4.0 Lが用意されています。
- 11ミリモル/ L 2,3 - ブタンジオンmonoxime（BDM）は手順1.1で作成した灌流液からデカントクレープス - ヘンゼライト溶液の1.0 Lに溶解させる。
- クレブス - ヘンゼライトの追加の150mLの手順1.1で作成した灌流液から除去し、5モル/ Lジ- 8 - ANEPPS（ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10ミリモル/ Lストックから希釈）と混合される。
- 5％のCO 2ガスを、これらの3ソリューションは、それらが41.0℃に予め温めておいたし、0.2μm、フィルタ処理された95％O 2を用いて水中バブラー（ラド）と酸素化されている水ジャケット付きガラスリザーバー（ラド）に転送されます。 3ストック貯水池からのソリューションは、MasterFlex™L / S蠕動ポンプと低吸収シリコーンチューブ（コール - パーマー）と壁掛けランゲンドルフシステムに圧送されています。
- 組立て前に、ランゲンドルフシステムガラス製品（ラド）は細心の注意を払って、E - TOXA - CLEAN試薬（Sigma - Aldrich社）で洗浄し、徹底的に0.1 M / LのHCl、100％エタノール、蒸留水でリンスする。
- 非循環ランゲンドルフ装置は、水ジャケット加熱コイルとバブルトラップ（ラド）[7]で心臓から分離される3つの別個の酸素貯蔵所、約70ミリメートルHg定圧を提供するために構築した。 3つの独立した灌流ラインは私達が正確に1.3〜ステップ1.1で作成したソリューションの配信を制御できるように、2つの3ウェイコックで心臓の上に収束する。水ジャケットガラス製品はMasterFlex PharMed BPTチューブ（コール - パーマー）と直列に接続し、℃の蒸留水で2 E100サーキュレータ（ラウダ）を使用して39に加温する。加熱コイルとバブルトラップに圧力ヘッドタンクを接続する白金硬化シリコンチューブ（コール - パーマー）による熱損失は、37℃灌流液が心臓に到達するまでになりました。
パート2：収穫ラットの心臓とセットアップランゲンドルフ灌流
- 200〜250グラムのルイスラットで深い全身麻酔を誘導するために、100 mg / kgのケタミンおよび10 mg / kgのキシラジンを腹腔内腔に注入される。この混合物に、我々は、植手順の実行中に血液凝固や心筋虚血を防ぐために、500 U / kgのヘパリンを追加します。
- 心臓や大血管へ簡単にアクセスするには、前胸壁が削除されます。その後、周囲の組織は注意深く切開し、心膜袋が開かれます。
- 下大静脈の同定に続いて、この容器は、5から0絹（エチコン）と連結されており、全体の心肺ブロックは、外植されています。組織はすぐに氷上に50 mLのビーカーに含まれる氷冷クレブス - ヘンゼライト溶液中に配置されます。
- 上行大動脈を素早く特定し、周囲の組織から解剖される。適切なサイズのカニューレは、（ハーバード装置）大動脈基部に遠くカニューレを挿入することによって冠状動脈の義務灌流を中断しないように注意しながら、大動脈に挿入されます。カニューレは、5から0絹（エチコン）で上行大動脈に固定されている。
- ラットの心臓は、カニューレ内に気泡を導入することなく、ランゲンドルフ装置上に配置されます。逆行性冠血管灌流は、現在のステップ1.6に説明した圧力ヘッドから暖かい、酸素クレブス - ヘンゼライト溶液を用いて確立されます。
- 肺を含む余分な組織が、、今削除され、心臓は、機能の回復を可能にし、リズムを安定させるために20分間灌流される。この時間の間に、非常に薄い熱電対温度プローブ（コール - パーマーは）左室内腔に導入し、5から0 Prolene縫合糸（エチコン）で所定位置に縫合。プローブは、心臓の温度が水の循環ポンプの設定を調整することによって37℃に維持されるようにサーモコントローラー（Digi - Keyはセンス）に接続されています。心尖部から滴り落ちる灌流液からの動きは、排水容器にガーゼを配置することによって最小化されます。
パート3：電位差色素で心臓をロードし、電子写真、光信号を取得する
- ジ- 8 - ANEPPS（Invitrogen）を三方活栓を用いて蛍光色素を混合したクレブス - ヘンゼライトを含む灌流ラインに切り替えることで、心臓にロードされます。さらに、18Gカニューレは、左及び/または右心房に配置され、それらが十分に冠状動脈を介して導入された染料で灌流されていないため、色素溶液の追加の50mLを徐々にこれらのチャンバーのそれぞれに投与される。
- ロード手順3 ECGのリード線（ハーバード装置）の間に穏やかにマッピングするのに使用される光学系を向いていない心臓の表面に配置されます。電極N O 1は、後部尖左心室の一部、N左心房のO 2、およびN上に位置している
- ECGアンプ（ヒューゴサックスElektronik社）の設定：ハイパスフィルター：0.1 Hzの
ローパスフィルタ：150Hzの - CMOSカメラ（留年選手イメージング）とmacroscopeは、心臓の表面に焦点が合っていると買収のフレームの中央になるようにXYZの調整を使用して配置されている。カメラと光学系は共振周波数を最小限に抑えるために（マイナスKテクノロジー）防振テーブル上に搭載されています。それと同時に、同軸ペーシング電極（ハーバード装置）は、隔離された、S48電気刺激装置（グラス）で制御右心房上に配置され、心臓は毎分300ビート（図1）でのペースです。
- 電気刺激（グラス）の設定：
レート：1秒あたり5パルス
ディレイ：0.2ミリ秒
期間：2ミリ
ボルト：6月12日V
モード：リピート
パルス：シングル - 収縮からのモーションアーチファクトを欠いている光学録音の場合、心臓に電気機械的に非結合する必要があります。我々は再び11ミリモル/ LのBDMを含むクレブス - ヘンゼライト溶液に灌流ラインを切り替えることによってこれを行います。買収の間に、心臓は、準備の生存を守るために純粋なクレブス - ヘンゼライトで灌流される。
- 記録パラメータは、次の買収の設定でソフトウェア（留年選手のイメージング）を使用して設定されます。
設定：2,000 Hzの、128 × 128ピクセルの配列
フレームの間隔：0.5ミリ秒
カメラのアンプ利得：5倍
オンチップゲイン：8X - 12Meウェル
シャッター：500ミリ秒の遅延
フレーム数：4000
期間：2000ミリ秒 - すべてのお部屋と設備のライトがオフになっているか、録音中にバックグラウンドノイズを除去するためにシールドされています。 LEDライトは光退色と色素の毒性を軽減する唯一の光記録中に、心を照らす。光源のシャッターは、コンピュータのD -対基板（留年選手イメージング）の方法でコントロールパネルを介して配信5 Vのパルスで制御されます。
パート4：赤シャツ党員のイメージングソフトウェアを使用して取得する情報を分析
- 買収後、データが異なるフィルタ設定を使用して処理されます。我々は一般的にバンドが44.0で左の境界と98.0で右の境界に設定されているフィルタを、ストップ/合格調整する場合を除いてデフォルト設定を使用します。その後記録された情報が処理され、ムービーが（留年選手の画像）が生成されます。
- 1回の収集からのデータは2秒の期間にわたって心臓の表面上の16384のサイトで地元の電気的活性化に対応しています。ソフトウェアは、これらのローカル信号を直接互いにと心房と心室の電子写真記録と比較することができます。データは、色に地元の電気的活性化をマッピングし、心臓の表面上に時空間の電気的活性化を示すアニメーションとしてこの情報をレンダリングにより可視化です。このようなアニメーションを作成するために、我々はソフトウェアを使用します。
- 時間的および/または空間的にデータをフィルタ
- アニメーションの開始時刻と終了時刻を選択
- 各ピクセルの静止光強度に基づいて、色にマップされた光信号
- 心臓の絵と結果の色のデータをオーバーレイ
- アニメーションを生成する
パート5：代表的な結果
灌流心臓標本の記録中に静止していた場合、光信号は、ジ- 8 - ANEPPSの発光強度の変化に関係するすべてのピクセルの1つの異なるピークを示す。対応する動画（図3および4）心臓の心外膜面だけでなく、同時に取得した電子写真記録（図2）を介して伝播する励起波の前面を示す。
図1。ランゲンドルフ灌流心臓標本の写真は、右心房のペーシング電極の位置を描いたとECGは、ステップ3.2で説明つながります。
図2。灌流ルイスラットの心臓からの代表的な光信号と電子写真記録。パネルは、光学イメージングに使用心外膜面の像を示しています。パネルBの時間をかけて蛍光発光の変化を示すために選択した画素の位置は、色付きの矢印で示されている。電子写真の信号は心房興奮及び心室の信号に対応するライトブルーのラインを示す赤い線とパネルCに示されています。してくださいve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg">この図の拡大バージョンを見るにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
麻酔ラットから心臓の除去は、心筋虚血を避けるために迅速に実行する必要があります。虚血または不十分な冠灌流が発生した場合、心臓はおそらく不整脈を開発し、梗塞になることがあります。さらに、これらの心は有益なレコーディングとその後の分析のための不十分な蛍光発光が表示されます。色素をロードする前に、心筋細胞は電気的な刺激の安定のための生理的電解質の環境を確立および維持するために十分にクレブス - ヘンゼライト溶液で灌流する必要があります。灌流液の正確な製剤は、適切な臓器の生存能力と機能を維持するために必要です。電解質の濃度または灌流の不十分なフィルタリングの違いは、おそらく致命的な心筋機能障害、心臓のリズム障害につながる。光学録音の場合は、心臓が完全に膜電位感受性色素をロードする必要があります。これらのチャンバーは冠状動脈が十分に灌流されていないので、これは心房心筋のために特に重要です。我々は、心房の追加の内空洞のある血流が良い光信号を確立することを見出した。さらに、最高品質の電圧のトレーシングの買収は、潅流心臓が動かないことが必要です、そうでない場合、蛍光発光の変化は確実に信号ドリフトに起因するアーチファクトに起因する高忠実度と膜電位の変化を追跡するために使用することはできません。これは、1つのピクセルに対して複数のピークではなく、単一のピークになります。光学録音からのモーションアーチファクトを排除するために他の方法は機械的固定化、他の興奮収縮uncouplers（例：サイトカラシンD、blebbistatin）による治療、信号処理、および数学的モデリング[1、8]が含まれています。最後に、このメソッドは、単に心臓の心外膜面上の活動電位の動きに関する情報を提供するここで説明する。代替組織の準備と赤外線電位差染料は、心臓の他の地域の電気伝搬特性を解決する可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
動物実験は、ボストン小児病院での動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
とボストン小児病院で心臓伝導基金への拠出、この作業は、研究の国立衛生研究所からの補助金（HL088206 HL068915）によってサポートされています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
