Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.
Abstract
Gliale cellen van zowel gewervelde en ongewervelde organismen moeten migreren naar uiteindelijke doelstelling regio's om te ensheath en te ondersteunen verbonden neuronen. Terwijl de recente vooruitgang is geboekt om de live-migratie van gliacellen te beschrijven in de ontwikkelingslanden popstadium vleugel (1), studies van<em> Drosophila</em> Gliale cel migratie hebben meestal gepaard met het onderzoek van vaste weefsel. Live-microscopische analyse van de beweeglijke cellen biedt de mogelijkheid om cellulaire gedrag te onderzoeken gedurende het migratieproces, inclusief het bepalen van de snelheid van en veranderingen in de richting van groei. Gepaard met het gebruik van genetische tools kunnen leven imaging worden gebruikt om meer precieze rol voor specifieke genen in het proces van ontwikkeling te bepalen. Eerder werk van Silies<em> Et al..</em> (2) heeft beschreven de migratie van glia afkomstig van de optische steel, een structuur die de zich ontwikkelende oog en de hersenen verbindt, in het oog denkbeeldige schijf in vaste weefsel. Hier schetsen we een protocol voor de behandeling van de live migratie van gliacellen in de<em> Drosophila</em> Oog imaginaire disc. We profiteren van een Drosophila lijn die GFP tot uitdrukking in de ontwikkeling van glia te volgen gliale cel progressie in wild type en in mutant dieren.
Protocol
Deel 1: Pre-experimentele set-up. Een week op voorhand, mate vliegt genereren larve die uitdrukken GFP onder de controle van een glia-specifieke promoter. Voor ons experiment hebben we gevisualiseerd GFP getagd met een nucleair lokalisatie volgorde uitgedrukt in gliale cellen met behulp van de omgekeerde polariteit (repo) promotor (3, 4). Bereid dekglaasjes ten minste een dag van tevoren door het weken 18 mm ronde dekglaasjes gedurende 10 minuten in 1% poly-L-lysine oplossing en de lucht dr…
Discussion
In dit protocol beschrijven we de observatie van gliale cel migratie in het oog denkbeeldige schijf met behulp van live-microscopie. In ons wild-type voorbeeld (figuur 1 AD), gebruikten we een nucleaire GFP marker om gliale cel beweging waarnemen in het oog disc in de loop van een uur. In een mutant voor een kandidaat-gen die nodig zijn voor gliale cel migratie momenteel onderzoek in ons laboratorium, zagen we een blokkering van gliale celkernen binnen de optische steel gedurende een periode van een uur (figuur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Patrick Cafferty wordt ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Poly-L-lysine
Reagent
Sigma
P8920
Schneider’s Insect Media
Reagent
Sigma
S0146
Penicillin-Streptomycin
Reagent
Sigma
P4458
Insulin solution from bovine pancreas
Reagent
Sigma
I0516
Chamlide Magnetic chamber
Tool
Live cell Instrument
CM-R-10
35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip
Ultra fine clipper scissors
Tool
Fine scientific tools
15200-00
Dumont #5 forceps
Tool
Fine scientific tools
11251-20
Fluorescent microscope
Microscope
Zeiss
Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used.
Cafferty, P., Xie, X., Browne, K., Auld, V. J. Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc. J. Vis. Exp. (29), e1155, doi:10.3791/1155 (2009).