Här beskriver vi ett protokoll för att undersöka migration av gliaceller i utvecklingsländerna Drosophila ögat använder levande mikroskopisk analys paras ihop med GFP taggade gliaceller.
Abstract
Gliaceller av både ryggradsdjur och ryggradslösa organismer måste migrera till slutmålet på regioner i syfte att ensheath och stöd i samband nervceller. Även om de senaste framstegen har gjorts för att beskriva den levande migration av gliaceller i utvecklingsländerna PUPP-vingen (1), studier av<em> Drosophila</em> Gliacellsmarkörer migration har normalt inblandade granskning av fast vävnad. Live mikroskopisk analys av rörliga celler ger möjlighet att undersöka cellulära beteende under hela vandrande, inklusive att fastställa graden av och förändringar i riktning mot tillväxt. Paras ihop med användning av genetiska verktyg kan leva avbildning användas för att bestämma mer exakt roller för specifika gener i utvecklingsprocessen. Tidigare arbete med Silies<em> Et al.</em> (2) har beskrivit migration av Glia kommer från synnerven stjälk, en struktur som förbinder utveckla ögat och hjärnan, i ögat imaginal skivan i fast vävnad. Här redogör vi för ett protokoll för att undersöka livemigrering av gliaceller i<em> Drosophila</em> Öga imaginal skiva. Vi drar nytta av en Drosophila linje som uttrycker GFP utveckla Glia följa gliacellsmarkörer progression i vildtyp och muterade djur.
Protocol
Del 1: Pre-experimentella uppsättning. En vecka i förväg, flugor kompis att generera larv som uttrycker GFP under kontroll av en gliaceller-specifika promotorn. För vårt experiment vi visualiseras GFP märkta med en nukleär lokalisering sekvens som uttrycks i gliaceller med omvänd polaritet (repa) promotor (3, 4). Förbered täckglas minst en dag i förväg genom att blötlägga 18 mm slinker runda locket i 10 minuter i 1% poly-L-lysin lösning och luft torka över natten. …
Discussion
I detta protokoll beskriver vi observation av gliacellsmarkörer migration i ögat imaginal skiva med live-mikroskopi. I vårt vild typ exempel (figur 1 AD), använde vi en nukleär GFP markör för att följa gliacellsmarkörer rörelse i ögat skivan under loppet av en timme. I en mutant för en kandidat gen som krävs för gliacellsmarkörer migration närvarande utreder i vårt laboratorium, observerade vi en blockering av stödjeceller cellkärnor inom optisk stjälk under en timmes tid (figur 1 EH). Vår …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Patrick Cafferty stöds av ett postdoktorsstipendium från Multiple Sclerosis Society of Canada.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Poly-L-lysine
Reagent
Sigma
P8920
Schneider’s Insect Media
Reagent
Sigma
S0146
Penicillin-Streptomycin
Reagent
Sigma
P4458
Insulin solution from bovine pancreas
Reagent
Sigma
I0516
Chamlide Magnetic chamber
Tool
Live cell Instrument
CM-R-10
35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip
Ultra fine clipper scissors
Tool
Fine scientific tools
15200-00
Dumont #5 forceps
Tool
Fine scientific tools
11251-20
Fluorescent microscope
Microscope
Zeiss
Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used.
Cafferty, P., Xie, X., Browne, K., Auld, V. J. Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc. J. Vis. Exp. (29), e1155, doi:10.3791/1155 (2009).