ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур
Summary
Вывод нейроэпителиальных предшественников из эмбриональных стволовых (ЭС) клеток с использованием стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA).
Abstract
ЭС клетки обладают потенциалом дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков, что делает их привлекательным инструментом для разработки новых методов лечения. В общем, дифференцировку ЭС клетки придерживается концепции сначала подготовить незрелых клеток-предшественников, которые затем могут быть распространены и дифференцировались в зрелых клеточных фенотипов. Это относится и к ЭСК полученных нейрогенез, в котором развитие нервных клеток является продолжением двух основных этапов: Во-первых, вывод и расширения незрелых нейроэпителиальных прекурсоров и во-вторых, дифференциация их в зрелые нервные клетки. Распространенным методом для производства нейронных прародителей из ЭС клеток основана на эмбриоидных тела (EB) образование, которое показывает, дифференцировки клеток от всех зародышевых листков в том числе нейроэктодермы. Альтернативный и более эффективный метод, чтобы побудить нейроэпителиальных развития клетка использует стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA), которая может быть достигнута путем совместного культивирования ЭС клетки и черепа костномозгового происхождения стромальных клеток (1). Оба, Е. Б. формирования и SDIA, показывают развитие розетка-подобных структур, которые, как считается, напоминают нервной трубки и / или нервного гребня, как прародителей. Нейронных прекурсоров может быть изолирован, расширение и дальнейшее дифференцировались в специфических нейронов и глии клеток с использованием определенных условиях культуры. Здесь мы описываем поколения и изоляции таких розетки во взаимодействии культуры эксперименты с стромальных клеточных линий MS5 (2-5).
Protocol
Discussion
Этот протокол демонстрирует различные этапы в создании и изоляции нейроэпителиальных клеток из человеческих клеток ES использованием SDIA. Применение этого метода состоит в многообразии и была использована во многих протоколов для производства указанных нейронов (например, 1, 2, 5-9). Розетки, как пол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| alpha-MEM | Gibco | 12571 | ||
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828 | ||
| MEM non-essential amino acid solution | Gibco | 12383 | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| mitomycin-C | Sigma | M0503 | ||
| gelatine type-A | Sigma | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 0.01 % solution | |
| laminin | Sigma | L-2020 | ||
| fibronectin | Sigma | F2006 | ||
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 ml syringe with 27 1/2 G needle | Becton Dickinson | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6 well plates | for tissue culture |
References
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
- Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
- Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
- Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
- Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
- Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
- Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
- Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
- Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).
