Afleiding van neuro voorlopers uit embryonale stamcellen (ES)-cellen met behulp van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA).
ES-cellen hebben de potentie om te differentiëren in de cellen van alle kiembladen, waardoor ze een aantrekkelijk instrument voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. In het algemeen is de differentiatie van ES-cellen volgt het concept om eerst te genereren onvolgroeide stamcellen, die vervolgens kunnen worden uitgedragen en gedifferentieerd tot volgroeide cellulaire fenotypes. Dit geldt ook voor de ES-cel afgeleide neurogenese, waarin de ontwikkeling van zenuwcellen volgt twee belangrijke stappen: Ten eerste, de afleiding en de uitbreiding van onvolwassen neuro precursoren en seconden, hun differentiatie tot volwassen neurale cellen. Een veel voorkomende methode om neurale voorlopercellen te produceren uit ES-cellen is gebaseerd op embryoid lichaam (EB) formatie, waarin de differentiatie van cellen uit alle kiembladen inclusief neuroectoderm onthult. Een alternatief en meer efficiënte methode om neuro-epitheliale cel ontwikkeling te induceren maakt gebruik van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA), die kan worden bereikt door co-kweken van embryonale stamcellen met de schedel beenmerg-afgeleide stromale cellen (1). Beide, EB vorming en SDIA, onthullen de ontwikkeling van de rozet-achtige structuren, die worden verondersteld om neurale buis lijken op-en / of neurale crest-achtige voorouders. De neurale voorlopers kunnen worden geïsoleerd, uitgebreid en verder gedifferentieerd in specifieke neuronen en glia cellen met behulp van bepaalde kweekomstandigheden. We beschrijven hier de generatie en het isolement van deze rozetten in co-cultuur van experimenten met de stromale cellijn MS5 (2-5).
Dit protocol laat de verschillende stappen in het genereren en het isoleren van neuro-epitheliale cellen van menselijke ES-cellen met behulp van SDIA. De toepassing van deze methode is veelzijdig en is gebruikt in tal van protocollen tot bepaalde neuronen produceren (bijv. 1, 2, 5-9). De rozetten worden verondersteld om neurale buis cellen met een voorste fenotype (2, 5, 10) lijken en ook de neurale lijst voorvaderen (11, 12) bevatten. Bovendien behouden ze een zekere mate van plasticiteit, omdat ze kunnen worden patroon door specifieke fac…
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
alpha-MEM | Gibco | 12571 | ||
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | ||
Knockout-DMEM | Gibco | 10829 | ||
Knockout serum replacement | Gibco | 10828 | ||
MEM non-essential amino acid solution | Gibco | 12383 | ||
DMEM/F12 | Gibco | 11330 | ||
N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
mitomycin-C | Sigma | M0503 | ||
gelatine type-A | Sigma | G1890 | ||
poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 0.01 % solution | |
laminin | Sigma | L-2020 | ||
fibronectin | Sigma | F2006 | ||
basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
1 ml syringe with 27 1/2 G needle | Becton Dickinson | 309623 | ||
N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
α-MEM media | medium | α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin | ||
MS5 | cell line | stromal cells | ||
Microscope | ||||
6 well plates | for tissue culture |