Summary

ES Cell-afgeleide neuro-epitheliale cel culturen

Published: November 30, 2006
doi:

Summary

Afleiding van neuro voorlopers uit embryonale stamcellen (ES)-cellen met behulp van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA).

Abstract

ES-cellen hebben de potentie om te differentiëren in de cellen van alle kiembladen, waardoor ze een aantrekkelijk instrument voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. In het algemeen is de differentiatie van ES-cellen volgt het concept om eerst te genereren onvolgroeide stamcellen, die vervolgens kunnen worden uitgedragen en gedifferentieerd tot volgroeide cellulaire fenotypes. Dit geldt ook voor de ES-cel afgeleide neurogenese, waarin de ontwikkeling van zenuwcellen volgt twee belangrijke stappen: Ten eerste, de afleiding en de uitbreiding van onvolwassen neuro precursoren en seconden, hun differentiatie tot volwassen neurale cellen. Een veel voorkomende methode om neurale voorlopercellen te produceren uit ES-cellen is gebaseerd op embryoid lichaam (EB) formatie, waarin de differentiatie van cellen uit alle kiembladen inclusief neuroectoderm onthult. Een alternatief en meer efficiënte methode om neuro-epitheliale cel ontwikkeling te induceren maakt gebruik van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA), die kan worden bereikt door co-kweken van embryonale stamcellen met de schedel beenmerg-afgeleide stromale cellen (1). Beide, EB vorming en SDIA, onthullen de ontwikkeling van de rozet-achtige structuren, die worden verondersteld om neurale buis lijken op-en / of neurale crest-achtige voorouders. De neurale voorlopers kunnen worden geïsoleerd, uitgebreid en verder gedifferentieerd in specifieke neuronen en glia cellen met behulp van bepaalde kweekomstandigheden. We beschrijven hier de generatie en het isolement van deze rozetten in co-cultuur van experimenten met de stromale cellijn MS5 (2-5).

Protocol

Stap 1 Plaat mitomycine-C ggrowth-remde (10 ug / ml voor 2,5 uur) MS5 cellen bij een dichtheid van 70.000 / cm2 op gelatine gecoate (0,01% gedurende 30 minuten) 6 goed platen in de α-MEM media. Wanneer de cellen worden bevestigd en hebben gevormd een monolaag ('s nachts groei), overschakelen naar SRM. Handmatig isoleren ES-cel kolonies van de ES-celkweken met behulp van een injectiespuit met een 27 ½ G naald. Zorgvuldig Tritrurate de kolonies met een 1 ml blauw tip en de pla…

Discussion

Dit protocol laat de verschillende stappen in het genereren en het isoleren van neuro-epitheliale cellen van menselijke ES-cellen met behulp van SDIA. De toepassing van deze methode is veelzijdig en is gebruikt in tal van protocollen tot bepaalde neuronen produceren (bijv. 1, 2, 5-9). De rozetten worden verondersteld om neurale buis cellen met een voorste fenotype (2, 5, 10) lijken en ook de neurale lijst voorvaderen (11, 12) bevatten. Bovendien behouden ze een zekere mate van plasticiteit, omdat ze kunnen worden patroon door specifieke fac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
L-glutamine   Gibco 25030  
alpha-MEM   Gibco 12571  
penicillin/streptomycin   Gibco 15140  
Knockout-DMEM   Gibco 10829  
Knockout serum replacement   Gibco 10828  
MEM non-essential amino acid solution   Gibco 12383  
DMEM/F12   Gibco 11330  
N2-A supplement   Stem Cell Technologies 07152  
mitomycin-C   Sigma M0503  
gelatine type-A   Sigma G1890  
poly-L-ornithine   Sigma P4957 0.01 % solution
laminin   Sigma L-2020  
fibronectin   Sigma F2006  
basic fibroblast growth factor (bFGF)   Invitrogen 13256  
1 ml syringe with 27 1/2 G needle   Becton Dickinson 309623  
N2-A media medium     DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM) medium     Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media medium     α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin
MS5 cell line     stromal cells
Microscope        
6 well plates       for tissue culture

References

  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

Play Video

Cite This Article
Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).

View Video