Härledning av neuroepiteliala prekursorer från embryonala stamceller (ES-celler) med hjälp av stromaceller-cellerna inducerande aktivitet (SDIA).
ES-celler har potential att differentiera till celler från alla groddblad, vilket gör dem till ett attraktivt verktyg för utveckling av nya behandlingsmetoder. I allmänhet följer differentiering av ES-celler konceptet att först skapa omogna stamceller, som sedan kan förökas och differentieras till mogna cellulära fenotyper. Detta gäller även för ES-cellerna neurogenes, i vilken utvecklingen av neurala celler följer två viktiga steg: först härledningen och utbyggnad av omogna neuroepiteliala prekursorer och andra, deras differentiering till mogna neurala celler. En vanlig metod för att producera neurala stamceller från ES-celler är baserad på embryoid kroppen (EB) bildande, som avslöjar differentiering av celler från alla groddblad inklusive neuroectoderm. Ett alternativt och mer effektiv metod att förmå neuroepiteliala cell utveckling använder stromaceller-cellerna inducerande aktivitet (SDIA), vilket kan uppnås genom samarbete odling ES-celler med skallen härledd från benmärg stromaceller (1). Både EB bildning och SDIA, avslöjar utvecklingen av rosett-liknande strukturer, som är tänkt att likna neuralrörsdefekter-och / eller neural crest-liknande stamceller. Den neurala prekursorer kan isoleras, utökat och ytterligare differentieras till specifika nervceller och celler Glia hjälp av definierade kultur villkor. Här beskriver vi generering och isolering av dessa rosetter i samarbete kultur experiment med stromaceller cellinje MS5 (2-5).
Detta protokoll visar de olika stegen i att skapa och isolera neuroepiteliala celler från mänskliga ES-celler med hjälp SDIA. Tillämpningen av denna metod är många och har använts i många protokoll för att producera specificerade nervceller (t.ex. 1, 2, 5-9). Den rosetter är tänkt att likna neuralrörsdefekter celler med en främre fenotyp (2, 5, 10) och även innehålla neural crest stamceller (11, 12). Dessutom behåller de en viss nivå av plasticitet, eftersom de kan vara mönstrad med specifika faktorer i definierade odlings…
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
alpha-MEM | Gibco | 12571 | ||
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | ||
Knockout-DMEM | Gibco | 10829 | ||
Knockout serum replacement | Gibco | 10828 | ||
MEM non-essential amino acid solution | Gibco | 12383 | ||
DMEM/F12 | Gibco | 11330 | ||
N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
mitomycin-C | Sigma | M0503 | ||
gelatine type-A | Sigma | G1890 | ||
poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 0.01 % solution | |
laminin | Sigma | L-2020 | ||
fibronectin | Sigma | F2006 | ||
basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
1 ml syringe with 27 1/2 G needle | Becton Dickinson | 309623 | ||
N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
α-MEM media | medium | α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin | ||
MS5 | cell line | stromal cells | ||
Microscope | ||||
6 well plates | for tissue culture |