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Biology

प्रौढ़ Zebrafish में इनर कान संवेदी epithelia के सकल और ठीक विच्छेदन ( Danio rerio)

doi: 10.3791/1211 Published: May 8, 2009

Summary

वयस्क zebrafish के भीतरी कान संवेदी उपकला वयस्क रीढ़ में बाल सेल पुनर्जनन के तंत्र को समझने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रणाली है. इस प्रोटोकॉल epithelia के ठीक विच्छेदन, जिसके माध्यम से हम सेलुलर और subcellular स्तर पर पुनर्योजी घटनाओं का अध्ययन करने के लिए ऊतक के नमूने प्राप्त कर सकते हैं दर्शाता है.

Abstract

Neurosensory epithelia भीतरी कान में सुनने और शेष कार्यों के लिए महत्वपूर्ण संरचनाओं हैं. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है epithelia, जो मुख्य रूप से कोशिकाओं के दो प्रकार से बना रहे हैं के सेलुलर और आणविक सुविधाओं को समझने: बाल (HCS) कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं (एससी). यहाँ हम न केवल वयस्क zebrafish में भीतरी कान संवेदी epithelia अध्ययन है क्योंकि उपकला संरचनाओं अत्यधिक सभी अध्ययन रीढ़ में संरक्षित कर रहे हैं के लिए चुनते हैं, लेकिन भी क्योंकि वयस्क zebrafish HCS, एक क्षमता है कि स्तनधारियों के जन्म के बाद शीघ्र ही खो पुनर्जन्म में सक्षम है. हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में वयस्क रीढ़ है कि कोर्ट के झड़ने के एक परिणाम के रूप में मानव में सुनवाई / संतुलन घाटे के नैदानिक ​​उपचार के लिए सहायक हो सकता में भीतरी कान कोर्ट उत्थान के तंत्र का अध्ययन वयस्क zebrafish के भीतरी कान का उपयोग करें.

यहाँ हम कैसे करने के लिए वयस्क zebrafish में भीतरी कान संवेदी epithelia के सकल और ठीक dissections प्रदर्शित. सकल विच्छेदन भीतरी कान के आसपास के ऊतकों को हटा और ऊतक वर्गों, जो हमें संवेदी epithelia की विस्तृत संरचना की जांच करने के लिए अनुमति देता है की तैयारी के लिए उपयोगी है. ठीक विच्छेदन साफ ​​प्रत्येक व्यक्ति उपकला के गैर संवेदी उपकला ऊतकों और हमें सक्षम बनाता है आसानी से पूरे माउंट उपकला नमूनों में पूरे उपकला की विविधता की जांच है.

Protocol

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भाग 1: ऊतक की तैयारी

  1. साथ वयस्क zebrafish euthanize एमएस 222 बफर (इथाइल 3-aminobenzoate methanesulfonate नमक, 0.03%).
  2. मछली सिर काटना. निचले जबड़े कट, उदर पक्ष के साथ विच्छेदन पैड पर सिर जगह है, और कीट पिन के साथ ऊतक स्थिर. खोपड़ी के लिए उदर नरम ऊतक निकालें और एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे ठीक चिमटी की एक जोड़ी के साथ खोपड़ी कैप्सूल के उदर भाग खुला दरार.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात paraformaldehyde में मछली सिर (4%) को ठीक करें.
  4. पीबीएस में तय मछली सिर कुल्ला (फास्फेट खारा buffered, 1X) 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए.

भाग 2: भीतरी कान के सकल विच्छेदन

  1. मछली सिर ventral तरफ ऊपर के साथ विच्छेदन पैड पर रखें. यह कीट पिन के साथ स्थिर करना. सभी निम्न चरणों विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे किया जाता है.
  2. ठीक चिमटी की एक जोड़ी के साथ, भीतरी कान पर खोपड़ी की हड्डी को हटाने और फिर ध्यान से बाहर खींच भीतरी कान के ऊतकों: saccules, lagenae, और utricles. saccule और lagena कसकर एक दूसरे से संलग्न कर रहे हैं और इस तरह एक साथ बाहर खींच जबकि utricle (saccule और lagena के लिए पूर्वकाल), बहुत से दूसरे छोर अंगों से विच्छेदन के दौरान अलग हो जाएगा संभावना है.
  3. भीतरी कान के ऊतकों पीबीएस (1X) में रखो. यदि कोई आगे ठीक विच्छेदन की जरूरत है, ऊतक पीबीएस (1X) के साथ 2-3 बार कुल्ला और यह अन्य प्रयोगों, जैसे cryosections के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

भाग 3: भीतरी कान संवेदी epithelia के ठीक विच्छेदन

  1. ठीक विच्छेदन एक साफ कांच स्लाइड पर पीबीएस (1X) की एक बूंद में किया जा सकता है.
  2. ठीक चिमटी के दो जोड़े के साथ utricular otolith utricle से निकालें और, अगर वांछित है, ठीक चिमटी की एक जोड़ी और एक सुई ब्लेड के साथ गैर - संवेदी उपकला और epithelia से innervation ऊतक ट्रिम.
  3. पहले अलग saccular और lagenar epithelia जबकि पूरे के रूप में संभव के रूप में बरकरार saccule रखने की कोशिश lagenar otolith निकालें. Ventral तरफ ऊपर के साथ पीबीएस ड्रॉप में ऊतक रखें. सुई ब्लेड का प्रयोग सावधानी saccule और lagena के बीच में कटौती. अत्यधिक गैर - संवेदी उपकला ऊतक और ठीक चिमटी और सुई ब्लेड के साथ innvervation छाँटो, यदि वांछित.

भाग 4: संवेदी epithelia में बालों की कोशिकाओं की प्रतिदीप्त धुंधला

  1. पीबीटी (1XPBS और 1% ट्राइटन X-100) के साथ 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए संवेदी epithelia कुल्ला.
  2. साथ epithelia सेते fluophore phalloidin (जैसे Alexa आटा 488 Phalloidin, 1:1,000 मन्दन) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए लेबल.
  3. 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीटी साथ संवेदी epithelia कुल्ला.
  4. बढ़ते मध्यम के साथ एक स्लाइड पर epithelia पर्वत और दाग उचित तरंगदैर्ध्य के फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे ऊतक की जांच.
  5. सफल विच्छेदन और धुंधला के बाद, मजबूत बाल सेल बंडल धुंधला के साथ बरकरार epithelia (1 छवि) माइक्रोस्कोप के अंतर्गत देखा जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Saccular संवेदी उपकला के बालों की कोशिकाओं Alexa आटा 488 Phalloidin (ग्रीन) के साथ दाग थे ऊतक का नमूना था. Dissected और दाग के रूप में समाचार पत्र में उल्लेख किया है. कई चित्र नमूना के विभिन्न पदों पर ले जाया गया और Adobe Photoshop 7.0 के साथ एक साथ टाइलों.
स्केल बार = 150μm.

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल में, हम वयस्क zebrafish, जो हमें संवेदी epithelia के सेलुलर और subcellular सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए ऊतक का नमूना तैयार करने के लिए सक्षम बनाता है के भीतरी कान संवेदी epithelia के सकल और ठीक विच्छेदन में वर्णित है.

आदेश में बाहर ले जाने के लिए एक सफल विच्छेदन, बहुत पहला कदम है, निर्धारण, बहुत महत्वपूर्ण है. सुनिश्चित करें कि आप हमेशा हौसले से तैयार paraformaldehyde समाधान का उपयोग करें, क्योंकि पुरानी समाधान ऊतकों कि विच्छेदन के दौरान संभाल के लिए मेहनत कर रहे हैं के तहत निर्धारण में परिणाम होगा बनाओ. हालांकि, यह सुनिश्चित करें कि आप उन्हें भी लंबे समय के लिए समाधान निर्धारण में छोड़ कर नहीं ऊतकों अधिक ठीक है, क्योंकि यह विच्छेदन के बाद प्रतिरक्षा / histological धुंधला के परिणामों के साथ हस्तक्षेप करेगा. इसके अलावा, अच्छी तरह से बनाए रखा विच्छेदन उपकरण है कि उपयुक्त आकारों में हैं का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से ठीक विच्छेदन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.

यह सकल विच्छेदन प्रोटोकॉल भी ऊतक विशेष DNAs / / RNAs और प्रोटीन की निकासी के लिए भीतरी कान के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उस मामले में, विच्छेदन paraformaldehyde निर्धारण के बिना मछली के बलिदान के बाद सही किया जा बाहर ले चाहिए. इसके अलावा, कुछ दिनचर्या तरीकों लक्ष्य अणुओं की गिरावट की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मछली सिर (कम जबड़ा हटाया) और rinsed किया जा सकता है ऊतक विशेष शाही सेना निकासी के लिए विच्छेदन के दौरान फिर RNAlater समाधान (Ambion) में डूब.

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Acknowledgments

इस शोध राष्ट्रीय मानव जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Reagent Sigma-Aldrich A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) Reagent Mediatech, Inc. 46-013-CM
Paraformaldehyde Reagent Sigma-Aldrich P-6148
Triton X-100 Reagent Sigma-Aldrich T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin Reagent Invitrogen A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI Reagent Vector Laboratories H-1500
Dissection microscope Microscope Nikon Instruments SMZ1000
Insect pins Tool Fine Science Tools 26000-40
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
Tweezers Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5045
Needle blade Tool Sharpoint 78-6810
Fluorescent microscope Microscope Carl Zeiss, Inc. Axiovert 200M
Dissection pad Tool eNasco SB07840M
Zebrafish Animal Various n/a

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Liang, J., Burgess, S. M. Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio). J. Vis. Exp. (27), e1211, doi:10.3791/1211 (2009).More

Liang, J., Burgess, S. M. Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio). J. Vis. Exp. (27), e1211, doi:10.3791/1211 (2009).

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