Summary
مطلوبة فصل التزاوج والرباعيات للتحليل الجيني في
Abstract
وحيدة الخلية الطحالب الخضراء
Protocol
الجزء 1 : إعداد سلالات لتكون الأعراس
ملاحظة : يجب أن يتم التلاعب بها في كل درجة حرارة الغرفة. وتتراوح درجات الحرارة أعلى أو أقل تؤثر على سرعة إنبات الزيجوت ويمكن أن تؤثر سلبا على قدرتها على البقاء.
الاعتبارات المهمة : من الضروري أن يكون لتزاوج سلالات تنمو بقوة وتكون خالية من الفطريات أو البكتيريا الملوثة. إذا كانت سلالات لم نقل بشكل منتظم ، ينبغي المرور على المتوسط الغنية تسبق توليد الأمشاج.
- يتم نقل سلالات أن تزاوج على لوحات وات (100 × 15 ملم) ، 1-2 سلالات لكل لوحة. يجب أن تنمو الخلايا في قطاع يتركز حوالي 1 سم في العرض.
- وينبغي على لوحات TAP حضانة تستمر حتى طبقة سميكة من الخلايا التي تنمو بقوة هو الحاضر ، مع نقل وسيطة إذا لزم الأمر. قد السلالات التي لم passaged مؤخرا تتطلب واحد ومرور ما مجموعه 1 أسبوع ، في حين أن السلالات البرية من نوع في الاستخدام المنتظم فقط قد يستغرق بضعة أيام والممرات لا. قد المسوخ التي هي حساسة للضوء تتطلب وقتا إضافيا.
- نقل كافة الخلايا من لوحات لوحات TAP N10 ، والتي هي قاصرة على النيتروجين وستبدأ للحث على تكون الأعراس. نقل الخلايا كما لوح سميك ، بقدر ما كانت موجودة على لوحة وات. هذا سوف يسهل جمع اللاحقة من الخلايا. بعد 3 أيام على N10 ، على استعداد للخضوع لهذه الخلايا تكون الأعراس. انقسام الخلية سيكون بطيئا على N10 ، ولكن ينبغي أن تظل خلايا خضراء داكنة. يجب التخلص من أي السلالات الملوثة كما لن بيضات ملقحة قابلة للحياة يمكن الحصول عليها.
الجزء 2 : التزاوج
- يتم نقل كل سلالة في دورق مخروطي 50 مل ومعلق في ما يقرب من 2.5 مل من الماء المقطر العقيمة. ويمكن القيام بذلك باستخدام إما حلقة سلكية أو عصا العقيمة ؛ ما هو مهم هو أن يتم تعليق جيدا الخلايا وليس في شكل كتل. وينبغي تعديل حجم الدقيق للمياه بحيث تركيز الخلية ، تم قياسه من خلال العين ، هو نفسه تقريبا بالنسبة لكل سلالة.
- يتم تحريكها الخلايا تحت ضوء قوي (1.260 μ E / م 2 / ثانية) لمدة 2 ساعة ، وخلال الوقت الذي سوف تصبح خلايا الأمشاج متحركة. يجب أن يتم التحقق حركية تحت المجهر الخفيفة. إذا الأمشاج هي السباحة نحو رديء ، التزاوج من المرجح أن تكون غير فعالة. ومع ذلك ، حتى سلالات ضعيفة متحركة رفيقة التردد المنخفض.
- المقبل ، وأحجام متساوية من طن متري + ويتم الجمع بين MT - الأمشاج في قارورة واحدة 50 ملم. يتم ترك الأمشاج تحت ضوء قوي (E μ 1.260 / م 2 / ثانية) من دون الانفعالات.
- يمكن التحقق التزاوج مباشرة تحت المجهر الضوئي. أزواج من الأمشاج شكل سريع ، وسوف تبدو وكأنها خلايا تتحرك بسرعة وانضم في سياط. إذا يبدو أن التزاوج يكون سريعا للغاية ، ينبغي أن تؤخذ العينات في غضون 30 دقيقة -1 ساعة لتوليد بيضات ملقحة. إن لم يكن ، يمكن التحقق التزاوج كل ساعة ، على الرغم من أن هذا هو اختياري. منذ العصور إعطاء الكثافة المثلى من بيضات ملقحة سوف تختلف على نطاق واسع بين الصلبان ، فمن الأفضل أن تأخذ aliquots من خليط التزاوج في أوقات مختلفة بعد الجمع بين الأمشاج ، على سبيل المثال بعد 1 ساعة ، ساعة 2 و 3 ساعات وساعات 4. يتم ذلك عن طريق تحويل 300 لعينات ميكرولتر TAP - 3 ٪ Difco آغار 60 × 15 مم لوحات ؛ البقع 3-4 في لوحة. يجب الحرص على عدم التحرك من الخليط التزاوج لأن ذلك قد يعطل أزواج التزاوج. يستخدم Difco آغار لأنها أقل من الملوثات ذات الأسعار المنخفضة agars ، وسيكون من السهل أن نرى بيضات ملقحة تحت المجهر.
يمكن ترك الخليط التزاوج غير المستخدمة في القارورة بين عشية وضحاها ، ونوعية رد الفعل التزاوج سوف يكون واضحا في اليوم التالي. عند التزاوج غير فعالة ، فإن الالتزام بيضات ملقحة أو الجدار السفلي من القارورة والمتوسطة وسوف تظهر واضحة. وحتى التحريض القارورة تفشل في طرد بيضات ملقحة. إذا لا شيء عصي على الزجاج عندما يتم تحريكها الخليط بقوة معقولة ، ثم تم التزاوج غير فعالة أو لم تتم. - يتم تجفيفها لوحات TAP - Difco تحتوي على خليط التزاوج في غطاء عقيمة ، مع أغطية مواربا ، حتى تم استيعاب أي السائل السطح. ويترك عادة لوحات في ضوء (700 شمال شرق / م 2 / ثانية) لمدة 18 ساعة ، ثم لف في احباط ، ومنذ نضوج بوغ لاقحي تبت إلا في الظلام. عبرت السلالات ، التزاوج الوقت والتاريخ على لوحات مكتوبة على حد سواء واحباط. يتم تخزين لوحات 5 إلى 7 أيام ، ويمكن أن تبقى لفترة أطول ، على الرغم من انخفاض إنبات الزيجوت الكفاءة تدريجيا.
الجزء 3 : تشريح الرباعيات
- يجب كشط الخلايا النباتية قبالة البقع الجافة مزيج التزاوج باستخدام شفرة مملة ، مثل مشرط. ويمكن استخدام شفرة لفضح مساحة بيضات ملقحة ، والتي ستلتزم باحكام آغار 3 ٪. وعادة ما يتم في هذه الخطوة بعد الظهر ، بحيث يكون بيضات ملقحة التي نبتت في صباح اليوم التالي ، ولكن لم يمر في الثانية ، التي من شأنها تقسيم الخضري8 العائد ذرية. المتلحفة البيولوجيين تتعلم بسرعة للاعتراف بيضات ملقحة تحت المجهر ، نظرا لأنها أكبر من الخلايا النباتية ، وميزة جدار سميك بوغ لاقحي الذي يعطي المخطط الأسود. Zygospores غالبا ما تظهر الصفراء ولكنها قد تكون أيضا الخضراء إلى حد ما. الحرف الأكثر أهمية هو أن التمسك آغار ، في حين يتم نقل الخلايا الخضرية بسهولة جانبا. ومع ذلك ، إذا لوحات جافة بشكل مفرط هذا لن يكون كذلك. أيضا ، إذا كان الخليط التزاوج كثيفة جدا ، قد بيضات ملقحة شكل حصيرة الذي سيجعل نقل بيضات ملقحة الفردية صعبا أو مستحيلا. تقام كثافات مناسبة في الخطوة 2.1 ، وسيتم تعلمت بسرعة من ذوي الخبرة.
- مستعدون لجمع الإبر الزجاج بيضات ملقحة وفصل ذرية الرباعيات. وتعد هذه من خلال سحب قضبان الزجاج 3 مم في لهب صغيرة لتوليد طويلة ، الخيط الرفيع ، والتي يمكن تنقطع. هي مهد نصائح من هذه الغايات مدبب أو عازمة على السنانير ، عن طريق تسخين وجيزة في لهب منخفض (مثل الكحول أو حرق مباراة). تعد الإبر والزجاج 3 أو أكثر ، نظرا لأنها تتكسر بسهولة إلى حد ما ، خاصة بالنسبة للمستخدمين عديمي الخبرة.
- نجتمع بيضات ملقحة على لوحة TAP - Difco 3 ٪ باستخدام إبرة في كومة من الزجاج الصغيرة. يتم تشكيل مربع من أجار (تصل إلى 0.5 سم 2) يحتوي على بيضات ملقحة ورفعه باستخدام مشرط مملة. ثم ، يتم وضع كتلة آغار وجهه لأسفل على طبق من ذهب 15 مم TAP - Difco 1.5 ٪ ، وتراجعت على طول خط أفقي نحو 1.5 سم من الجزء العلوي من لوحة ، لتوزيع بيضات ملقحة. وحفرت في السطر العلوي الأفقي ، والشبكة مع ما يقرب من 1.5 سم و 0.5 التباعد الأفقي الطول الرأسي في الجزء الخلفي من لوحات. وستستخدم الشبكة في اليوم التالي كدليل لفصل ذرية الرباعيات (يمكن أيضا أن تكون الشبكة محفورا في اليوم من تشريح). أخيرا ، بيضات ملقحة الفردية الانتقال إلى تقاطعات خطوط أفقية أعلى مع كل خط عمودي ، مع حوالي 2-30 بيضات ملقحة لكل لوحة. بالرغم من أنه سيتم تشريح سوى 12 أو نحو ذلك ، وليس كل اقحة تنبت ، وبعض سوف تقسم مرتين قبل أن تنفجر ، وهناك حاجة بيضات ملقحة خارج ذلك.
- بعد توزيع يتم قتل بيضات ملقحة ، والخلايا النباتية التي تم نقلها عن طريق الخطأ من لوحة آغار 3 ٪ من خلال تعريض لوحة مقلوب لمدة 30 ثانية على طبق من الزجاج تحتوي على رقيقة (1-2 ملم) من طبقة الكلوروفورم. وينبغي أن المسافة بين لوحة وكلوروفورم تكون حوالي 5 سم. إذا تم استخدام الكلوروفورم كثيرا ، أو إذا كانت المسافة كبيرة جدا أو صغيرة ، واحدة من المخاطر قتل إما بيضات ملقحة ، أو أنه لم يقتل الخلايا النباتية. يجب أن يتم العلاج على الفور بعد كلوروفورم تم توزيع zygospores على لوحة الإنبات ، لضمان الانتقائية.
- إنبات يأخذ 16-20 ساعة بالنسبة لمعظم السلالات ، ولكن سوف تختلف مع التركيب الوراثي ومع عمر بيضات ملقحة. للإنبات ، وتوضع لوحات تحت الضوء المنخفض (239 شمال شرق / م 2 / ثانية) ، أو في ضوء خافتة المتوسطة التي تغطي لوحة بمنديل.
- ويمكن تحديد بيضات ملقحة نبتت تحت المجهر كخلايا تورم أو الاندفاع في بعض الأحيان مع ابنة الخلايا بداخلها. إذا كان بوغ لاقحي لم تمزق ، وسوف تلمس برفق مع إبرة الزجاج كسر جدار الإنبات إذا حدث. تم سحبها بلطف الخلايا الوليدة إلى نقاط الشبكة تحت الزيجوت. فمن الأسهل القيام بذلك من خلال الكشف عن خلية في كمية صغيرة من السائل المتوسطة التي صدرت من قبل آغار ضغط الإبرة والزجاج ، وسحب هذا "بركة" وراء الإبرة. نموذج واحد من "التأمين" أن على المرء أن تشريح a اقحة وليس الخلية النباتية التي تقسم مرتين ، هو أنه بغض النظر عن الخلايا ابنة الأربعة ، فإن "الجلد" من الجدار بوغ لاقحي لا تزال قائمة.
- وتزرع على سلالة تشريح تحت الظروف المناسبة حتى يمكن التقاطها clonies مرئية لتحليل لاحقة. وينبغي رصد لوحات اليومية للتلوث.
ملاحظة : لا تغطي توليد diploids الخضري هنا ، ولكن ينطوي أساسا الطلاء المخلوط على التزاوج المتوسطة التي لن تدعم نمو إما سلالة الأبوية ، ولكن من شأنها دعم نمو مضاعفا (مثل علامات two auxotropic مختلفة). وتحفظ لوحات في ضوء لتجنب تشكيل بيضات ملقحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التحليل الجيني هو بسيط في المتلحفة ، ولكنه يتطلب تقنيات خاصة لتوليد الأمشاج ومنفصلة ذرية الرباعيات. مع سلالات صحية ، ويتم الحصول بسهولة على التقنيات. مع بعض سلالات متحولة ، يصبح أكثر من فن ، والقراء الرجوع المجلد 1 من المرجع المتلحفة نشرت مؤخرا عن المذكرات التاريخية وتلميحات العملي. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هناك العديد من الاختلافات حول موضوع الأساسية المذكورة أعلاه ، بدءا من طريقة لتحفيز تكون الأعراس ، إلى نمط توزيع اقحة وتشريح. في نهاية المطاف ، كل يرى الباحث منطقتهم الراحة ، أو تتكيف مع بروتوكولات محددة المختبر.
وينبغي أن بعض التفاصيل التقنية المذكورة أعلاه ، وكرر. على وجه الخصوص ، يجب أن تكون الخلايا سليمة ودون أي إصابة. ومن المعروف جيدا أن مختبر مكيفة السلالات التي لم عبرت لفترات طويلة قد لا لم بشكل جيد ، ونوعية المياه قد يؤثر أيضا على تكون الأعراس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويستند هذا البروتوكول على تقنيات علم في مختبر فرانسيس أندريه ولمان في فرنسا المعهد البيولوجيا الفيزيائية Chimique ، باريس. الكتاب مدينون بالعرفان لBascou جيرارد جاكلين ، الذي قدم أصلا DBS إلى التقنيات الجينية المتلحفة. معتمد المتلحفة البحوث في المختبر والمؤلفين من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم جائزة MCB - 0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
