Summary
L'accouplement et la séparation des tétrades sont nécessaires pour l'analyse génétique dans
Abstract
L'algue verte unicellulaire
Protocol
Partie 1: Préparation des souches pour la gamétogenèse
Remarque: Toutes les manipulations doivent être effectuées à température ambiante. Températures supérieures ou inférieures auront une incidence sur la vitesse de germination zygote et peuvent nuire à la viabilité.
Considération importante: Il est essentiel que des souches à croissance robuste sont accouplés et sont libres de contamination des champignons ou des bactéries. Si les souches n'ont pas été transférés régulièrement, le passage sur milieu riche devrait précéder la génération de gamètes.
- Les souches d'être accouplés sont transférés sur des plaques TAP (100 × 15 mm), 1-2 souches par plaque. Les cellules doivent être cultivées dans une bande de concentrés d'environ 1 cm de largeur.
- L'incubation des plaques TAP devrait se poursuivre jusqu'à une épaisse couche de cellules à croissance robuste est présent, avec des transferts intermédiaires si nécessaire. Les souches qui n'ont pas été récemment repiquées peut exiger un passage et un total de 1 semaine, alors que les souches de type sauvage en usage régulier ne peut prendre de quelques jours et pas de passages. Mutants qui sont sensibles à la lumière peut exiger un délai supplémentaire.
- Transfert de toutes les cellules de la TAP pour les plaques plaques N10, qui sont déficientes pour l'azote et va commencer à induire la gamétogenèse. Transférer les cellules comme une dalle épaisse, un peu comme ils étaient présents sur la plaque de la TAP. Cela facilitera la collecte ultérieure des cellules. Après 3 jours sur la N10, les cellules sont prêtes à subir la gamétogenèse. La division cellulaire va être lent sur N10, mais les cellules doivent rester vert foncé. Toute souches contaminés doivent être jetés comme des zygotes viables ne sera pas obtenu.
Partie 2: L'accouplement
- Chaque souche est transféré dans un erlenmeyer de 50 ml et remises en suspension dans environ 2,5 ml d'eau distillée stérile. Cela peut être fait soit en utilisant une boucle de fil ou un bâton stérile; ce qui est important est que les cellules sont bien suspendues et non en touffes. Le volume exact d'eau doit être ajustée de sorte que la concentration cellulaire, comme mesuré par l'œil, est sensiblement le même pour chaque souche.
- Les cellules sont agités sous une forte lumière (1,260 E μ / m 2 / s) pendant 2 heures, temps pendant lequel les cellules deviennent les gamètes mobiles. Mobilité doit être vérifié au microscope optique. Si les gamètes sont la natation mal, l'accouplement est susceptible d'être inefficace. Cependant, même mal souches mobiles s'accouplent une fréquence réduite.
- Ensuite, des volumes égaux de mt + et MT-gamètes sont combinés en un seul flacon 50 ml. Les gamètes sont de gauche, sous une forte lumière (1,260 E μ / m 2 / s) sans agitation.
- L'accouplement peut être vérifiée immédiatement sous le microscope optique. Paires de gamètes se forment rapidement, et apparaîtra comme les cellules se déplaçant rapidement rejoint à la flagelle. Si l'accouplement semble être extrêmement rapide, les échantillons doivent être prises dans les 30 min -1 hr pour la génération des zygotes. Si non, l'accouplement peut être vérifié à chaque heure, bien que ceci est optionnel. Depuis les temps donnant la densité optimale des zygotes varient largement entre les croix, il est préférable de prendre des aliquotes du mélange d'accouplement à différents moments après la combinaison des gamètes, par exemple après 1 h, 2 h, 3 h et 4 heures. Cela se fait en transférant 300 échantillons uL à TAP-3% de gélose Difco 60 x 15 mm plaques; taches 3-4 par assiette. Attention à ne pas agiter le mélange d'accouplement, car cela pourrait perturber les paires d'accouplement. Gélose Difco est utilisé parce qu'il a moins de contaminants que bas prix géloses, et il sera plus facile de voir zygotes sous le microscope.
Le mélange d'accouplement inutilisée peut être laissé dans le ballon pendant la nuit, et la qualité de la réaction de l'accouplement sera évident le jour suivant. Lorsque l'accouplement est efficace, les zygotes se conformer au mur ou au fond du flacon et le milieu apparaissent clairement. Même l'agitation de la fiole ne parviendra pas à déloger les zygotes. Si rien ne colle à la vitre quand le mélange est agité avec force raisonnable, alors l'accouplement a été inefficace ou n'a pas eu lieu. - Les plaques TAP-Difco contenant un mélange d'accouplement sont séchées dans une hotte stérile, avec les couvercles entrouverte, jusqu'à ce que tout liquide de surface a été absorbé. Les plaques sont généralement laissés à la lumière (700 E / m 2 / s) pour 18 heures, puis enveloppés dans une feuille, car la maturation zygospore n'aura lieu que dans l'obscurité. Les souches franchi, l'accouplement heure et la date sont écrites sur les plaques et le papier d'aluminium. Les plaques sont stockées 5 à 7 jours et peuvent être conservés plus longtemps, bien que l'efficacité de germination zygote diminue progressivement.
Partie 3: Dissection Tétrade
- Cellules végétales doivent être grattées taches sèches du mélange d'accouplement avec une lame émoussée, comme un scalpel. La lame peut être utilisée pour exposer une zone de zygotes, qui collera bien à l'agar à 3%. Cette étape se fait habituellement dans l'après-midi, de sorte que les zygotes ont germé dès le lendemain matin, mais n'ont pas subi une seconde, la division végétative quirendement de 8 progéniture. biologistes Chlamydomonas rapidement apprendre à reconnaître les zygotes sous le microscope, car elles sont plus grandes que les cellules végétatives, et disposent d'un mur épais zygospore qui donne un contour noir. Zygospores apparaissent souvent jaune, mais peut aussi être un peu vert. Le personnage le plus important est qu'elles collent à la gélose, tandis que les cellules végétatives sont facilement écarté. Cependant, si les plaques sont trop sec ce ne sera pas le cas. Aussi, si le mélange d'accouplement était trop dense, les zygotes peuvent former un tapis qui fera le transfert de zygotes individuels difficiles, voire impossibles. Densités appropriées sont établies à l'étape 2.1, et sera vite appris avec l'expérience.
- Aiguilles de verre sont préparés pour recueillir les zygotes et séparant la descendance tétrade. Ce sont préparés en tirant 3 tiges de verre mm dans une petite flamme pour produire un long fil mince, qui peut être rompu. Les pointes de ces extrémités effilées sont lissées ou plié en crochets, en chauffant dans une flamme brève faible (par exemple l'alcool ou une allumette en feu). Préparer 3 ou plus des aiguilles de verre, car ils cassent assez facilement, surtout pour les utilisateurs inexpérimentés.
- Zygotes sont rassemblés sur les 3% de TAP-Difco plaque à l'aide d'une aiguille de verre dans un petit tas. Un carré de gélose (jusqu'à 0,5 cm 2) contenant les zygotes est formé et excisées en utilisant une sourde scalpel. Ensuite, le bloc d'agar est placé face cachée sur un 15 mm 1,5% TAP-Difco plaque, et a glissé le long d'une ligne horizontale d'environ 1,5 cm du haut de la plaque, pour distribuer les zygotes. La ligne horizontale supérieure, et une grille d'environ 1,5 cm de l'espacement horizontal et 0,5 cm verticaux sont gravés dans le dos des plaques. La grille sera utilisée le jour suivant comme guide pour la séparation de la descendance tétrade (la grille peut également être gravé le jour de dissection). Enfin, les zygotes individuels sont passer à l'intersection des lignes horizontale supérieure avec chaque ligne verticale, avec environ 20-30 zygotes par plaque. Bien que seulement 12 ou plus sera disséqué, ne sont pas tous zygote germe, et certains vont diviser deux fois avant d'éclater, les zygotes afin supplémentaires sont nécessaires.
- Après avoir distribué les zygotes, et les cellules végétatives qui ont été accidentellement transférée de la plaque de gélose à 3% sont tués en exposant la plaque retournée pendant 30 secondes sur un plat en verre contenant une mince (1-2 mm) couche de chloroforme. La distance entre la plaque et le chloroforme devrait être d'environ 5 cm. Si trop de chloroforme est utilisé, ou si la distance est trop petit ou grand, on risque soit de tuer les zygotes, ou ne pas tuer les cellules végétatives. Le traitement au chloroforme doit être effectuée immédiatement après la zygospores ont été distribués sur la plaque de la germination, pour assurer la sélectivité.
- La germination prend 16-20 heures pour la plupart des souches, mais varie avec le génotype et l'âge des zygotes. Pour la germination, les plaques sont placées sous un faible éclairage (239 E / m 2 / s), ou dans la lumière estompée moyennes en couvrant la plaque avec un tissu.
- Zygotes germées peuvent être identifiés au microscope que les cellules gonflées ou parfois éclater avec des cellules filles à l'intérieur. Si la zygospore n'a pas rompu, touchant légèrement avec une aiguille de verre se brisera le mur si la germination s'est produite. Les cellules filles sont doucement traînés aux points de grille ci-dessous le zygote. Il est plus facile de faire cela en capturant les cellules dans une petite quantité de milieu liquide libéré de la gélose par la pression de l'aiguille de verre, et en faisant glisser cette «flaque» derrière l'aiguille. Une forme de «assurance» que l'on a disséqué un zygote et non une cellule végétative qui a deux fois divisés, c'est qu'à part les cellules fille de quatre, la «peau» du mur zygospore restera.
- La progéniture disséqués sont cultivés dans des conditions appropriées jusqu'à clonies visible peut être choisi pour une analyse ultérieure. Les plaques doivent être surveillés quotidiennement pour la contamination.
Remarque: la génération des diploïdes végétative ne sont pas couverts ici, mais consiste essentiellement plaquage le mélange d'accouplement sur le milieu qui ne favorise pas la croissance de la souche parentale soit, mais de soutenir la croissance du diploïde (par exemple, deux marqueurs différents auxotropic). Les plaques sont conservées dans la lumière pour éviter la formation de zygotes.
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Discussion
L'analyse génétique est simple chez Chlamydomonas, mais elle nécessite des techniques particulières pour générer des gamètes et la progéniture tétrade séparé. Avec les souches saines, les techniques sont facilement acquises. Avec certaines souches mutantes, il devient de plus d'un art, et les lecteurs doivent se reporter tome 1 du Sourcebook publié récemment des Chlamydomonas notes historiques et des conseils pratiques. Par ailleurs, il convient de noter qu'il ya beaucoup de variations sur le thème de base décrit ci-dessus, allant de la méthode de la gamétogenèse induisant, pour le modèle de distribution zygote et de dissection. En définitive, chaque chercheur trouve leur zone de confort, ou adapte au laboratoire de protocoles spécifiques.
Certains détails techniques mentionnés ci-dessus, doit être réaffirmé. En particulier, les cellules doivent être sains et sans aucune infection. Il est bien connu que les souches adaptées au laboratoire qui n'ont pas été franchi pendant de longues périodes peut pas s'accoupler bien, et la qualité de l'eau peut également influer sur la gamétogenèse.
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Acknowledgments
Ce protocole est basé sur les techniques apprises dans le laboratoire de Francis-André Wollman à la France Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris,. Les auteurs ont une dette de gratitude à Jacqueline Girard-Bascou, qui avait initialement introduit DBS aux techniques de Chlamydomonas génétique. Chlamydomonas la recherche dans le laboratoire de l'auteur »est soutenu par la National Science Foundation récompense MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
