Summary
Paarung und Tetrade Trennung sind für die genetische Analyse benötigt
Abstract
Die einzellige Grünalge
Protocol
Teil 1: Vorbereitung der Stämme für Gametogenese
Hinweis: Alle Manipulationen sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Höhere oder niedrigere Temperaturen beeinträchtigen die Geschwindigkeit der Zygote Keimung und können sich negativ auf die Lebensfähigkeit.
Wichtige Überlegung: Es ist wichtig, dass die Stämme zu paaren sind robust wachsen und sind frei von verunreinigenden Pilze oder Bakterien. Wenn die Stämme nicht regelmäßig übertragen worden sind, sollten Passage auf Vollmedium vorausgehen Generation von Keimzellen.
- Strains zu verpaart werden auf TAP-Platten (100 × 15 mm), 1-2 Stämme pro Platte übertragen. Die Zellen sollten in eine konzentrierte Streifen ca. 1 cm in der Breite angebaut werden.
- Inkubation auf TAP Platten sollte bis eine dicke Schicht robust wachsenden Zellen vorhanden ist, mit Zwischen-Transfers, wenn nötig. Stämme, die nicht kürzlich passagiert eventuell ein Durchgang und insgesamt 1 Woche, während Wildtyp-Stämme in regelmäßigen Gebrauch nur kann ein paar Tage und keine Passagen. Mutanten, die lichtempfindlich sind eventuell zusätzliche Zeit.
- Übertragen Sie alle Zellen aus der TAP Platten N10 Platten, die noch unzureichend für Stickstoff und beginnt zu Gametogenese induzieren. Übertragen Sie die Zellen als eine dicke Platte, so wie sie auf dem TAP-Platte wurden. Dies erleichtert die anschließende Sammlung der Zellen. Nach 3 Tagen auf N10 werden die Zellen bereit, Gametogenese unterziehen. Die Zellteilung wird langsam auf N10, jedoch Zellen sollten dunkelgrün bleiben. Jede kontaminierte Stämme zu verwerfen als lebensfähig Zygoten nicht erreicht werden wird.
Teil 2: Mating
- Jeder Stamm wird in einen 50 ml Erlenmeyerkolben überführt und erneut in ca. 2,5 ml sterilem destilliertem Wasser. Dies kann entweder mittels einer Drahtschlinge oder einer sterilen Stick sein, was wichtig ist, dass die Zellen gut suspendiert sind und nicht in Klumpen. Die genaue Menge Wasser sollte so eingestellt sein, dass die Zellkonzentration, wie mit dem Auge abschätzen, etwa die gleiche für jeden Stamm ist.
- Die Zellen werden unter starkem Licht (1,260 μ E / m 2 / sec) für 2 Stunden gerührt, während welcher Zeit die Zellen beweglich Gameten werden. Motilität sollte unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Wenn die Gameten schlecht schwimmen, ist Paarung wahrscheinlich ineffizient. Allerdings wird auch schlecht bewegliche Stämme Kumpel eine verminderte Häufigkeit.
- Next gleiche Volumen von mt + und mt-Gameten sind in einem einzigen 50 ml Flasche kombiniert. Gameten werden unter starkem Licht (1,260 μ E / m 2 / sec) ohne Bewegung nach links.
- Mating sofort unter dem Lichtmikroskop überprüft werden. Paare von Gameten bilden sich rasch, und erscheint so schnell bewegenden Zellen trat bei der Geißeln. Wenn Paarung zu sein scheint extrem schnelle, sollten die Proben innerhalb von 30 min -1 hr für die Erzeugung von Zygoten genommen werden. Wenn nicht, können Paarung jede Stunde überprüft werden, obwohl dies optional. Seit Zeiten geben die optimale Dichte von Zygoten stark variieren wird zwischen kreuzt, ist es am besten, Aliquots der Paarung Mischung zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Vereinigung Gameten, z. B. nach 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden und 4 Stunden. 3-4 Punkte pro Platte; Dies ist durch die Übertragung von 300 ul Proben TAP-3% Difco-Agar 60 × 15 mm-Platten durchgeführt. Achten Sie darauf, nicht auf die Paarung Mischung rühren, als dieser Paarung Paare stören können. Difco-Agar wird verwendet, weil sie weniger Schadstoffe als preisgünstigere Agars hat, und es wird einfacher sein, Zygoten unter dem Mikroskop zu sehen.
Die nicht verwendeten Paarung Mischung kann in der Flasche über Nacht stehen gelassen werden, und die Qualität der Paarung Reaktion wird offensichtlich am nächsten Tag. Beim Stecken effizient ist, werden die Zygoten an der Wand oder Boden des Kolbens haften und das Medium erscheint klar. Auch Bewegung der Kolben wird nicht die Zygoten zu entfernen. Wenn nichts haftet an Glas, wenn die Mischung mit hinreichender Kraft bewegt wird, dann Paarung war ineffizient oder gar nicht stattfinden. - Die TAP-Difco-Platten, die Paarung Mischung in eine sterile Haube getrocknet, mit dem Deckel offen, bis jeder Oberfläche Flüssigkeit aufgesogen ist. Die Platten sind in der Regel in das Licht (700 nE / m 2 / sec) für 18 Stunden belassen, dann in Folie verpackt, da Zygospore Reifung nur stattfinden wird in der Dunkelheit. Die Stämme gekreuzt, Paarung Uhrzeit und Datum werden auf beiden Platten und die Folie geschrieben. Platten gespeichert sind 5 bis 7 Tage und länger gehalten werden, obwohl Zygote Keimung Effizienz sinkt schrittweise.
Teil 3: Tetrad Dissection
- Vegetative Zellen sollten ausgeschaltet werden getrocknet Flecken der Paarung Mischung mit einer stumpfen Klinge, wie ein Skalpell abgekratzt. Die Klinge kann verwendet werden, um eine Fläche von Zygoten, die dicht halten wird, die 3%-Agar freizulegen. Dieser Schritt ist in der Regel nachmittags durchgeführt, so dass die Zygoten haben am nächsten Morgen gekeimt, aber nicht eine zweite, vegetative Teilung, die würde unterzogenAusbeute 8 Nachkommen. Chlamydomonas Biologen lernen schnell, Zygoten unter dem Mikroskop zu erkennen, da sie größer als vegetative Zellen, und verfügen über einen dicken Zygospore Wand, die eine schwarze Kontur verleiht. Zygosporen oft gelb erscheinen, kann aber auch etwas grün. Die wichtigste Zeichen ist, dass sie auf Agar-Stick, während vegetative Zellen leicht bewegt werden beiseite. Allerdings sind, wenn die Platten zu trocken wird dies nicht der Fall sein. Auch, wenn die Paarung Mischung zu dicht wurde, kann Zygoten Form einer Matte, die machen Übertragung einzelner Zygoten schwierig oder unmöglich wird. Entsprechende Dichten sind in Schritt 2.1 etabliert und wird schnell mit der Erfahrung gelernt werden.
- Glass Nadeln sind für die Sammlung und Trennung Zygoten Tetrade Nachkommen vorbereitet. Diese werden durch Ziehen 3 mm Glasstäbe in einer kleinen Flamme zu einem langen, dünnen Faden, der auch scheitern kann generieren vorbereitet. Die Spitzen dieser verjüngten Enden geglättet oder in die Haken gebogen, durch kurzes Erhitzen in einer kleinen Flamme (z. B. Alkohol oder ein brennendes Zündholz). Bereiten Sie 3 oder mehr Glasnadeln, da sie relativ leicht zu brechen, vor allem für unerfahrene Anwender.
- Zygoten auf die 3%-TAP-Difco Platte mit einem Glas Nadel in einen kleinen Haufen versammelt. Ein Quadrat von Agar (bis 0,5 cm 2) mit den Zygoten gebildet und ausgeschnitten mit einem stumpfen Skalpell. Dann wird der Agar-Block Gesicht nach unten auf eine 15 mm 1,5% TAP-Difco Platte, und rutschte entlang einer horizontalen Linie ca. 1,5 cm von der Oberseite der Platte, auf die Zygoten zu verteilen. Die obere horizontale Linie, und ein Gitter mit ca. 1,5 cm horizontal und 0,5 cm vertikalen Abstand in die Rückseite der Platten geätzt. Das Raster wird verwendet am folgenden Tag als Leitfaden für die Trennung der Tetrade Nachkommen (das Netz kann auch der Tag der Dissektion geätzt werden). Schließlich sind einzelne Zygoten auf die Schnittpunkte der oberen horizontalen Linien mit jeweils vertikalen Linie bewegen, mit etwa 20-30 Zygoten pro Platte. Obwohl nur 12 oder so wird seziert, nicht jede Zygote keimt, und einige werden zweimal teilen vor dem Bersten sind so zusätzliche Zygoten benötigt.
- Nach der Verteilung der Zygoten und vegetativen Zellen, die versehentlich von der 3%-Agar-Platte übertragen werden, indem die umgekehrte Platte für 30 Sekunden bei einem Glas Schale mit einer dünnen (1-2 mm) Schicht aus Chloroform getötet. Der Abstand zwischen der Platte und Chloroform sollte etwa 5 cm betragen. Wenn zu viel Chloroform verwendet wird, oder wenn der Abstand zu klein oder groß, riskiert man entweder die Tötung der Zygoten, oder nicht die Tötung der vegetativen Zellen. Die Chloroform-Behandlung muss sofort erfolgen, nachdem die Zygosporen auf die Keimung Platte verteilt worden sind, um die Selektivität zu gewährleisten.
- Die Keimung dauert 16-20 Stunden für die meisten Stämme, sondern wird mit Genotyp und mit dem Alter der Zygoten variieren. Für die Keimung werden die Platten unter schwachem Licht (239 nE / m 2 / sec) platziert oder in Medium Licht durch das Abdecken der Platte mit einem Gewebe abgeblendet.
- Gekeimten Zygoten können unter dem Mikroskop als geschwollen oder manchmal platzen Zellen mit Tochterzellen in ihnen identifiziert werden. Wenn die Zygospore nicht gebrochen hat, wird sanft berührte mit einem Glas Nadel brechen die Wand, wenn die Keimung erfolgt ist. Daughter Zellen werden vorsichtig auf die Rasterpunkte unterhalb der Zygote gezogen. Am einfachsten ist es, diese durch die Erfassung der Zelle in eine kleine Menge flüssigen Medium aus dem Agar durch den Druck des Glases Nadel freigesetzt, und ziehen diese "Pfütze" hinter der Nadel zu tun. Eine Form der "Versicherung", dass man eine Zygote und nicht um eine vegetative Zelle, die zweimal geteilt hat seziert, ist, dass abgesehen von den vier Tochter-Zellen, die "Haut" der Zygospore Wand bleiben.
- Die seziert Nachkommen sind unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, bis sichtbare clonies für die anschließende Analyse ausgewählt werden können. Die Platten sollten täglich auf Verschmutzungen kontrolliert werden.
Hinweis: Generation des vegetativen Diploiden wird hier nicht behandelt, aber im Wesentlichen um Ausplattieren der Paarung Mischung auf Medium, das nicht unterstützt wird das Wachstum der beiden elterlichen Stammes, sondern wird das Wachstum des diploiden (zB zwei verschiedene auxotrophen Marker) zu unterstützen. Die Platten werden in das Licht, um die Bildung von Zygoten vermeiden gehalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetische Analyse ist einfach in Chlamydomonas, aber es erfordert spezielle Techniken, um Gameten und separate Tetrade Nachkommen zu erzeugen. Mit gesunder Stämme sind die Techniken leicht erworben. Bei einigen Mutanten, wird es eher eine Kunst, und der Leser sollte Band 1 der kürzlich veröffentlichten Chlamydomonas Sourcebook für historische Anmerkungen und praktische Hinweise beziehen. Darüber hinaus ist anzumerken, dass es viele Variationen über das Grundthema oben beschrieben, von der Methode zur Induktion Gametogenese, um das Muster der Zygote Verteilung und Dissektion werden. Letztlich findet jeder Forscher ihre Komfort-Zone, oder passt sich an Labor-Protokolle.
Bestimmte technische Details erwähnt, sollte wiederholt werden. Insbesondere müssen die Zellen gesund und ohne Infektion. Es ist bekannt, dass das Labor angepasste Sorten, die nicht für längere Zeit überschritten worden, die nicht zufriedenstellend mate, und die Wasserqualität kann sich auch auf Gametogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dieses Protokoll basiert auf Techniken, die in dem Labor von Francis-André Wollman am Institut de Biologie Physikalisch-Chimique, Paris, Frankreich gelernt basiert. Die Autoren schulden Dank Jacqueline Girard-Bascou, die ursprünglich eingeführt DBS zu Chlamydomonas genetischen Techniken. Chlamydomonas Forschung in der Autoren-Labor von der National Science Foundation Award MCB-0646350 wird unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
