Summary
Çiftleşme ve tetrad ayrılması genetik analiz için gerekli olan
Abstract
Tek hücreli yeşil alg
Protocol
Bölüm 1: gametogenezis için suşlarının Hazırlık
Not: Tüm manipülasyonlar oda sıcaklığında yapılmalıdır. Yüksek veya düşük sıcaklıklarda Zigot çimlenme hızını etkileyebilir ve canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir.
Önemli göz: evlendirilmeyecek suşları sağlam büyüyen ve kirlenmesine neden olan mantar veya bakteri olduklarını şarttır. Suşları düzenli olarak devredilmiştir varsa, zengin ortamda geçişi gamet nesil önce gerekir.
- Evlendirilmeyecek Suşlarının TAP levhalar (100 × 15 mm), plaka başına 1-2 suşları üzerine aktarılır. Hücreler, yaklaşık 1 cm genişlikte konsantre bir şerit büyüdü olmalıdır.
- Sağlam büyüyen hücreleri kalın bir tabaka kadar TAP plakalar üzerinde Kuluçka gerekirse ara transferleri ile devam etmelidir. Düzenli kullanım yabani tip suşlar, bir kaç gün ve hiçbir geçişleri sadece sürebilir ancak son zamanlarda geçişli henüz Suşlarının, bir geçit ve 1 hafta olmak üzere toplam gerekebilir. Işığa duyarlı Mutants ek süre isteyebilir.
- Azot eksikliği vardır ve gametogenezis ikna etmek için başlayacak N10 tabak, TAP plakalar tüm hücreleri aktarın. TAP plaka üzerine kadar kalın bir levha gibi hücrelerin aktarın. Bu hücrelerin daha sonraki toplama kolaylaştıracaktır. N10 3 gün sonra, hücreleri gametogenezis geçmesi hazırlanmıştır. Hücre bölünmesi N10 yavaş olur, ancak hücreleri koyu yeşil kalmalıdır. Canlı zigot elde olmayacak gibi herhangi bir kontamine suşları atılmalıdır.
Bölüm 2: Çiftleşme
- Her suş 50 ml erlen aktarılır ve yaklaşık 2,5 ml steril distile su ile yeniden süspanse. Bu, ya bir tel döngü ya da steril bir sopa kullanarak yapılabilir; neyin önemli olduğunu, hücrelerin yığınlarda iyi askıya değildir bu. Kesin su hacmi göz tarafından ölçülür hücre konsantrasyonu, her bir suş için yaklaşık aynı şekilde ayarlanmalıdır.
- Hücreler 2 saat boyunca kuvvetli ışık altında (1.260 μ E / m 2 / sn) telaşlı, heyecanlı, hareketli gamet hücreleri olacak ve bu süre boyunca. Motilite ışık mikroskobu altında kontrol edilmelidir. Gamet kötü yüzme iseniz, çiftleşme verimsiz olması muhtemeldir. Ancak, kötü hareketli suşlar bile daha düşük bir frekans arkadaşı.
- Sonraki eşit hacimleri mt + ve mt-gamet tek bir 50 ml ölçülü balona birleştirilir. Gamet ajitasyon olmadan güçlü ışık (1.260 μ E / m 2 / sn) altında bırakılır.
- Çiftleşme ışık mikroskobu altında hemen kontrol edilebilir. Gametlerin çiftleri hızla formu ve hızlı hareket eden hücreler kamçı olarak katıldı görünecektir. Çiftleşme son derece hızlı olması belirirse, örnekler zigot bir nesil için 30 dakika -1 saat içinde alınması gerekmektedir. Eğer değilse, bu isteğe bağlı olduğu halde, çiftleşme, her saat başı kontrol edilebilir. Zigot optimal yoğunluk vererek kez haç arasında yaygın olarak değişecektir, 1 saat, 2 saat, 3 saat ve 4 saat sonra gametler, örneğin birleştirerek sonra farklı zamanlarda çiftleşme karışımı hacimde almak en iyisidir. Plaka başına 3-4 noktalar; 300 mcL örnekleri TAP-3% Difco agar 60 × 15 mm plakalar aktararak yapılır. Bu çiftleşme çiftleri bozabilir çiftleşme karışımı karıştırma dikkatli olun. Düşük fiyatlı agars daha az kirletici maddeler ve mikroskop altında zigot görmek için daha kolay olacaktır çünkü Difco agar kullanılır.
Kullanılmayan çiftleşme karışımı bir gecede balonuna sol ve çiftleşme tepki kalitesi ertesi gün açık olacak. Çiftleşme verimli, zigot balonun veya duvar dibine uyacaktır ve orta net görünecektir. Hatta balonun ajitasyon zigot çıkarmak için başarısız olacaktır. Hiçbir karışımı makul canlılığı ile çalkalanır cam çubukları, daha sonra çiftleşme verimsiz veya yer almadı. - Çiftleşme karışımı içeren TAP Difco plakaları, her yüzeyde sıvı emilmiş kadar aralık kapaklı, steril bir kaput kurutulur. Zygospore olgunlaşma sadece karanlıkta gerçekleşecek bu yana plakalar genellikle, daha sonra folyoya sarılı, 18 saat ışık (700 nE / m 2 / sn) bırakılır. Suşları, saat ve tarih çiftleşme plakaları ve folyo hem yazılı, geçti. Zigot çimlenme verimliliği giderek azalır rağmen Tabaklar, 5 ila 7 gün saklanır ve daha uzun tutulabilir.
Bölüm 3: tetrad Diseksiyon
- Vejetatif hücreler bir neşter gibi sıkıcı bir bıçak kullanarak çiftleşme karışımı kuru noktalar, kazınmalı. Bıçak% 3 agar sıkıca sadık olacaktır zigot bir alan ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu adım, genellikle zigot Ertesi sabah çimlenmiş var ki, öğleden sonra yapılır, ama bir ikinci, vejetatif bölünme uğramamış8 döl verimi. Chlamydomonas biyologlar hızla vejetatif hücreler daha büyük ve siyah bir taslak veren kalın bir zygospore duvar özelliği bu yana, mikroskop altında zigot tanımayı öğrenin. Zygospores genellikle sarı görünür ama aynı zamanda biraz yeşil olabilir. Vejetatif hücreler kolayca kenara taşınır en önemli karakteri, agar sopa. Ancak, plakalar halinde aşırı Bu durumda olmayacak kuru. Ayrıca, çiftleşme karışımı çok yoğun ise, zigot bireysel zigot transferi zor veya imkansız hale getirecek bir minder kurabilir. Uygun yoğunlukları adım 2.1 'de kurulan ve tecrübesi ile hızlı bir şekilde öğrenmiş olacak.
- Cam iğneler zigot toplama ve tetrad döl ayıran için hazırlanmıştır. Bu kopmuş olabilir, uzun, ince bir iplik üretmek için küçük bir alev 3 mm cam çubuklar çekerek hazırlanmıştır. Bu sivri uçları ipuçları, kancalar, düşük alev (örneğin alkol ya da yanan bir maç) kısa süreli ısıtma düzeltti veya bükülmüş. Özellikle deneyimsiz kullanıcılar için oldukça kolay kırılabilir, 3 veya daha fazla cam iğneler hazırlayın.
- Zigot küçük bir kazık içine bir bardak iğne kullanılarak% 3 TAP Difco plaka üzerinde toplanmıştır. Zigot içeren agar bir kare (0.5 cm kadar 2) oluşan ve sıkıcı bir neşter kullanılarak eksize edilir. Sonra agar bloğu, 15 mm,% 1.5 TAP-Difco plaka üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde yerleştirilir ve zigot dağıtmak için, yaklaşık 1,5 cm plakasının üst yatay bir çizgi boyunca kaydırdı. Üst yatay çizgi, ızgara, yaklaşık 1,5 cm yatay ve 0,5 cm dikey aralık ile plakaların arkasına kazınmış. Grid (ızgara da diseksiyon gün kazınacak) tetrad döl ayırmak için bir kılavuz olarak ertesi gün kullanılacaktır. Son olarak, bireysel zigot plaka başına 20-30 zigot, her bir dikey çizgi ile üst yatay çizgilerin kesişmeleri taşıyın. Disseke sadece 12 ya da olacak her zigot filizlenir değil, ve bazı patlama önce iki kez böleceğiz rağmen, bu kadar ekstra zigot ihtiyaç vardır.
- Dağıtarak sonra yanlışlıkla% 3 agar plaka devredilmiştir zigot ve vejetatif hücreleri kloroform (1-2 mm) ince bir tabaka içeren bir cam tabak üzerinde 30 saniye boyunca ters plaka teşhir ederek öldürdü. Plaka ve kloroform arasındaki mesafe yaklaşık 5 cm olmalıdır. Çok kloroform kullanıldığında ise mesafe çok küçük ya da büyük olup olmadığını, ya da bir riskleri ya zigot öldürme, ya da vejetatif hücreleri öldürerek değil. Zygospores seçiciliği sağlamak için, çimlenme plaka dağıtılmıştır sonra kloroform tedavi hemen yapılmalıdır.
- Çimlenme suşlarının çoğu 16-20 saat sürer, ancak genotip ve zigot yaşı ile değişecektir. Çimlenme için, plakalar düşük ışık (239 nE / m 2 / sn) altında yerleştirilir, ya da orta ışığında bir doku ile plaka kapsayan soluk .
- Çimlendirilmiş zigot, içlerinde kızı hücreleri ile şişmiş ya da bazen patlama hücreler olarak mikroskop altında tespit edilebilir. Zygospore rüptüre değilse çimlenme meydana varsa, bir cam iğne ile hafifçe dokunarak duvarı kıracak. Kızı hücreleri hafifçe zigot altındaki grid noktaları sürüklenebilir. Agar serbest cam iğne basıncı ile sıvı bir ortamda küçük bir miktar hücre yakalama ve iğne arkasında bu "su birikintisi" sürükleyerek bunu kolayıdır. "Sigorta", tek bir zigot ve iki kez bölünmüş olan bir vejetatif hücre disseke olduğu bir form dışında dört kızı hücreleri, zygospore duvar "deri" olarak kalacaktır.
- Sonraki analiz için görünür clonies alınabilir kadar disseke döl uygun koşullar altında yetiştiriliyor. Tabaklar kirlenme günlük olarak takip edilmelidir.
Not: vejetatif diploitler nesil burada ele, ama aslında her iki ebeveyn suşu büyümeyi desteklemek orta çiftleşme karışım kaplama içerir, ancak büyüme diploid (örneğin iki farklı auxotropic belirteçleri) destek verecek değildir. Tabaklar, zigot oluşumunu önlemek için ışık tutulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetik analiz Chlamydomonas basit, ama özellikle teknikleri gamet ve ayrı tetrad döl oluşturmak için gereklidir. Sağlıklı soylarının teknikleri kolayca elde edilir. Bazı mutant suşları ile bir sanat daha fazla olur ve okuyucular, tarihsel notlar ve pratik ipuçları yakın zamanda yayınlanan Chlamydomonas Kaynak Kitabı, Cilt 1 bakmalıdır. Ayrıca, bu temel tema çok varyasyon Zigot dağıtım ve diseksiyon desen, indükleyici gametogenezis yöntemi arasında değişen, yukarıda açıklanan olduğunu belirtmek gerekir. Sonuçta, her araştırmacının kendi konfor bölgesi bulur, ya da laboratuar özel protokoller uyum sağlar.
Bazı teknik detaylar, yukarıda belirtilen yineledi olmalıdır. Özellikle, hücrelerin sağlıklı ve herhangi bir enfeksiyon olmaksızın olmalıdır. Bu uzun süre geçti henüz suşları iyi arkadaşı olmayabilir laboratuvar uyarlanmış ve su kalitesi de gametogenezis etkileyebilir bilinir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu protokol, Institut de biologie fiziko-Chimique, Paris, Fransa'da Francis-André Wollman laboratuvarda öğrenilen teknikleri dayanmaktadır. Yazarların aslında Chlamydomonas genetik teknikleri DBS tanıttı Jacqueline Girard-Bascou, şükran borçluyuz. Yazarların laboratuar Chlamydomonas araştırma, Ulusal Bilim Vakfı ödülü MCB-0646350 tarafından destekleniyor .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
