Summary
Acasalamento e separação tetrad são necessários para análise genética em
Abstract
A alga verde unicelular
Protocol
Parte 1: Preparação de cepas de gametogênese
Nota: Todas as manipulações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Temperaturas superiores ou inferiores irá afetar a velocidade de germinação zigoto e pode afetar adversamente a viabilidade.
Consideração importante: é essencial que as cepas de ser acoplado estão crescendo robustamente e estão livres de contaminação de fungos ou bactérias. Se as cepas não foram transferidos regularmente, passagem em meio rico deve preceder geração de gametas.
- Cepas para ser acoplado são transferidos para placas TAP (100 × 15 mm), 1-2 cepas por placa. As células devem ser cultivadas em uma faixa concentrada cerca de 1 cm de largura.
- Incubação em placas TAP deve continuar até que uma espessa camada de forma robusta as células de crescimento está presente, com as transferências intermediárias, se necessário. Cepas que não foram recentemente várias passagens podem exigir uma passagem e um total de uma semana, enquanto que linhagens selvagens em uso regular pode levar apenas alguns dias e sem passagens. Mutantes que são sensíveis à luz pode necessitar de tempo adicional.
- Transferência de todas as células das placas TAP para placas de N10, que são deficientes de nitrogênio e começarão a induzir a gametogênese. Transferência das células como uma laje de espessura, tanto quanto eles estavam presentes na placa TAP. Isso irá facilitar a recolha subsequente das células. Após 3 dias em N10, as células são preparados para passar gametogênese. Divisão celular será lenta no N10, no entanto as células devem permanecer verde escuro. Qualquer cepas contaminados devem ser descartados como zigotos viáveis não será obtida.
Parte 2: Acasalamento
- Cada cepa é transferido para um erlenmeyer de 50 ml e ressuspenso em aproximadamente 2,5 ml de água destilada estéril. Isto pode ser feito usando um laço de arame ou um pedaço de pau estéril; o que é importante é que as células estão bem suspensa, e não em grupos. O volume exato de água deve ser ajustada de modo que a concentração de células, como medido por olho, é aproximadamente o mesmo para cada estirpe.
- Células são agitadas sob a luz forte (1,260 E μ / m 2 / s) por 2 horas, tempo durante o qual as células se tornará gametas móveis. Motilidade deve ser verificada com um microscópio de luz. Se os gametas estão nadando mal, o acasalamento é susceptível de ser ineficiente. No entanto, mesmo mal cepas móveis será companheiro de uma freqüência reduzida.
- Em seguida, volumes iguais de mt mt + e-gametas são combinados em um único frasco ml 50. Gametas são deixados sob a luz forte (1,260 E μ / m 2 / s), sem agitação.
- Acasalamento pode ser verificado imediatamente sob o microscópio de luz. Pares de gametas formam rapidamente, e aparecerá como células que se move rapidamente juntou-se ao flagelo. Se o acasalamento parece ser extremamente rápida, as amostras devem ser tomadas no prazo de 30 hr min -1 para a geração de zigotos. Se não, o acasalamento pode ser verificado a cada hora, embora isto seja opcional. Desde os tempos dando a densidade ideal de zigotos irá variar muito entre cruzes, é melhor tomar alíquotas da mistura de acasalamento em diferentes momentos após a combinação de gametas, por exemplo, após 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas. Isto é feito através da transferência de 300 amostras mL a TAP-3% agar Difco 60 × 15 placas mm; pontos 3-4 por prato. Tenha cuidado para não agitar a mistura de acasalamento, pois isso pode atrapalhar os casais. Difco agar é usado porque ele tem menos de contaminantes de menor preço ágares, e será mais fácil ver zigotos sob o microscópio.
A mistura de acasalamento não utilizado pode ser deixado no frasco durante a noite, ea qualidade da reação de acasalamento será óbvio no dia seguinte. Quando o acasalamento é eficiente, os zigotos irá aderir à parede ou fundo do frasco eo meio será claro. Mesmo agitação do frasco deixará de desalojar os zigotos. Se varas nada para o vidro quando a mistura é agitada com vigor razoável, de acasalamento, em seguida, foi ineficiente ou não ter lugar. - As placas TAP Difco contendo mistura de acasalamento são secos em uma capa estéril, com as tampas abertas, até que o líquido de superfície tenha sido absorvida. As placas são geralmente deixados à luz (700 NE / m 2 / s) por 18 horas, em seguida, embrulhado em papel alumínio, uma vez que a maturação zygospore só terá lugar no escuro. As cepas cruzou, o acasalamento hora ea data são escritos em ambas as placas e as folhas. Placas são armazenados 5 a 7 dias e podem ser mantidos por mais tempo, embora a eficiência de germinação do zigoto declina progressivamente.
Parte 3: Dissecção Tétrade
- Células vegetativas deve ser raspada manchas secas de mistura de acasalamento usando uma lâmina cega, como um bisturi. A lâmina pode ser usada para expor uma área de zigotos, que vai ficar bem para o ágar 3%. Este passo é feito geralmente no período da tarde, para que os zigotos têm germinado na manhã seguinte, mas não submetido a uma divisão, segundo vegetativo querendimento de 8 progênie. biólogos Chlamydomonas aprender rapidamente a reconhecer zigotos sob o microscópio, já que eles são maiores do que as células vegetativas, e apresentam uma parede grossa zygospore que dá um contorno preto. Zygospores muitas vezes aparecem amarelo, mas também pode ser um pouco verde. O personagem mais importante é que eles furar a agar, enquanto as células vegetativas são prontamente mudou de lado. No entanto, se as placas são excessivamente seco este não será o caso. Além disso, se a mistura de acasalamento era muito denso, zigotos podem formar uma esteira que vai fazer a transferência de zigotos individuais difícil ou impossível. Densidades adequadas são estabelecidas no passo 2.1, e serão rapidamente aprendeu com a experiência.
- Agulhas de vidro são preparados para a recolha de zigotos e separando progênie tétrade. Estes são preparados por puxar três bastões de vidro mm em uma pequena chama para gerar um fio longo e fino, que pode ser quebrada. As dicas destes extremidades afiladas são suavizadas ou dobrado em ganchos, por aquecimento em um breve fogo baixo (álcool ou um fósforo aceso). Prepare 3 ou mais agulhas de vidro, uma vez que eles quebram facilmente, especialmente para usuários inexperientes.
- Zigotos estão reunidos na 3% placa TAP Difco, usando uma agulha de vidro em uma pilha pequena. Um quadrado de agar (até 0,5 cm 2), contendo os zigotos é formado e retirado com um bisturi maçante. Então, o bloco de agar é colocado de bruços sobre a 15 mm Placa de 1,5% TAP Difco, e deslizou ao longo de uma linha horizontal de cerca de 1,5 cm do topo da placa, para distribuir os zigotos. A linha superior horizontal, e uma grade com cerca de 1,5 cm horizontal e 0,5 cm vertical espaçamento são gravados na parte de trás das placas. A grade será utilizado no dia seguinte como um guia para separar a progênie tétrade (a grade também pode ser gravado no dia da dissecção). Finalmente, zigotos individuais são mover-se para as intersecções das linhas horizontal superior com cada linha vertical, com cerca de 20-30 zigotos por placa. Embora somente 12 ou assim vai ser dissecado, nem todos os zigoto germina, e alguns vão dividir duas vezes antes de estourar, então zigotos extras são necessários.
- Após distribuir os zigotos e células vegetativas que foram acidentalmente transferidos da placa de ágar 3% são mortos por exposição da placa invertida por 30 segundos sobre um prato de vidro contendo uma camada (1-2 mm) de espessura de clorofórmio. A distância entre a placa eo clorofórmio devem ficar cerca de 5 cm. Se clorofórmio é muito usado, ou se a distância for muito pequena ou grande, se arrisca quer o abate zigotos, ou não matar as células vegetativas. O tratamento clorofórmio deve ser feito imediatamente após a zygospores foram distribuídos na chapa de germinação, para garantir a seletividade.
- Germinação leva 16-20 horas para a maioria das cepas, mas vai variar com o genótipo e com a idade dos zigotos. Para a germinação, as placas são colocadas sob pouca luz (239 NE / m 2 / s), ou em luz média esmaecido, cobrindo a placa com um lenço de papel.
- Zigotos germinadas podem ser identificados sob o microscópio as células inchadas ou às vezes estourar com células-filhas dentro deles. Se o zygospore não rompeu, tocando suavemente com uma agulha de vidro vai quebrar a parede, se a germinação ocorreu. Células-filhas são suavemente arrastada para os pontos de grade abaixo do zigoto. É mais fácil fazer isso através da captação da célula de uma pequena quantidade de meio líquido liberado do ágar pela pressão da agulha de vidro, e arrastando essa "poça" por trás da agulha. Uma forma de "seguro" de que se tem dissecou um zigoto e não uma célula vegetativa que tem o dobro dividido, é que além da filha de quatro células, a "pele" da parede zygospore permanecerá.
- A progênie dissecados são cultivadas em condições adequadas até clonies visível podem ser colhidas para análise posterior. As placas devem ser monitorados diariamente para a contaminação.
Nota: Geração de diplóides vegetativo não é coberto aqui, mas envolve essencialmente a mistura de revestimento de acasalamento em meio que não irá apoiar o crescimento de qualquer cepa parental, mas vai apoiar o crescimento do diplóide (por exemplo, dois marcadores auxotropic diferentes). Placas são mantidas na luz para evitar a formação de zigotos.
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Discussion
Análise genética é simples em Chlamydomonas, mas exige técnicas específicas para gerar gametas e progênie tetrad separado. Com cepas saudável, as técnicas são facilmente adquiridos. Com alguns mutantes, torna-se mais de uma arte, e os leitores devem consultar Volume 1 do Livro de Chlamydomonas recentemente publicado por notas históricas e dicas práticas. Além disso, deve-se notar que há muitas variações sobre o tema básico descrito acima, que vão desde o método para induzir gametogênese, para o padrão de distribuição zigoto e dissecção. Em última análise, cada pesquisador encontra sua zona de conforto, ou se adapta ao laboratório de protocolos específicos.
Certos detalhes técnicos mencionados acima, deve ser reiterado. Em particular, as células devem ser saudáveis e sem qualquer infecção. É bem sabido que em laboratório adaptado cepas que não foram cruzadas por longos períodos pode não acasalar bem, ea qualidade da água também pode afetar a gametogênese.
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Acknowledgments
Este protocolo é baseado em técnicas aprendidas no laboratório de Francis-André Wollman na França Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris,. Os autores têm uma dívida de gratidão para com Jacqueline Girard-Bascou, que originalmente introduzido DBS para Chlamydomonas técnicas genéticas. Chlamydomonas pesquisa no laboratório dos autores é suportado pelo National Science Foundation prêmio MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
