Summary
L'accoppiamento e separazione tetrade sono necessari per l'analisi genetica in
Abstract
L'alga verde unicellulare
Protocol
Parte 1: Preparazione dei ceppi per gametogenesi
Nota: Tutte le manipolazioni devono essere effettuate a temperatura ambiente. Temperature maggiori e minori influenzerà la velocità di germinazione zigote e può influenzare negativamente la vitalità.
Considerazione importante: è essenziale che i ceppi di essere accoppiati sono in crescita robusta e sono privi di contaminanti funghi o batteri. Se le tensioni non sono stati trasferiti regolarmente, passaggio in terreno ricco deve precedere la generazione dei gameti.
- I ceppi di essere accoppiati vengono trasferite su piastre TAP (100 × 15 mm), 1-2 ceppi per piastra. Le cellule devono essere coltivate in una striscia di concentrato di circa 1 cm di larghezza.
- L'incubazione sulle piastre TAP dovrebbe continuare fino a quando una spessa coltre di robusta crescita delle cellule è presente, con i trasferimenti intermedi, se necessario. I ceppi che non sono stati diversi passaggi di recente può richiedere un passaggio e un totale di 1 settimana, mentre i ceppi wild-type in uso regolare può essere effettuato solo pochi giorni e senza passaggi. Mutanti che sono sensibili alla luce può richiedere più tempo.
- Trasferire tutte le cellule dalle piastre TAP per piatti N10, che sono carenti di azoto e inizierà a indurre gametogenesi. Trasferire le cellule come una lastra di spessore, tanto quanto erano presenti sulla piastra TAP. Questo faciliterà la successiva raccolta delle cellule. Dopo 3 giorni di N10, le cellule sono disposti a sottoporsi ad gametogenesi. La divisione cellulare sarà lenta su N10, tuttavia le cellule deve rimanere verde scuro. Qualsiasi ceppi contaminati deve essere scartato come zigoti vitali non si otterrà.
Parte 2: accoppiamento
- Ogni sforzo è trasferito in un beuta da ml 50 e risospeso in circa 2,5 ml di acqua distillata sterile. Questo può essere fatto sia utilizzando un ciclo filo o un bastone sterile, ciò che è importante è che le cellule sono ben sospesa e non in gruppi. Il volume esatto di acqua dovrebbe essere regolato in modo che la concentrazione delle cellule, come misurato ad occhio, è circa lo stesso per ogni ceppo.
- Le cellule sono agitato di una forte luce (E 1,260 μ / m 2 / sec) per 2 ore, durante le quali le cellule diventeranno gameti mobili. Motilità devono essere controllati al microscopio ottico. Se i gameti sono il nuoto male, l'accoppiamento rischia di essere inefficiente. Tuttavia, anche mal ceppi mobili si accoppia una frequenza ridotta.
- Successivamente, volumi uguali di mt + e mt-gameti sono combinati in un unico pallone da ml 50. Gameti sono lasciati di una forte luce (E 1,260 μ / m 2 / sec) senza mescolare.
- L'accoppiamento può essere controllato immediatamente sotto al microscopio ottico. Coppie di gameti forma rapidamente, e appariranno come le cellule in rapido movimento unito al flagelli. Se l'accoppiamento risulta essere estremamente rapido, i campioni devono essere presa entro h 30 min -1 per la generazione di zigoti. In caso contrario, l'accoppiamento può essere controllata ogni ora, anche se questo è opzionale. Fin dai tempi dando la densità ottimale di zigoti varia notevolmente tra croci, è meglio prendere aliquote della miscela di accoppiamento in tempi diversi, dopo che combina gameti, ad esempio dopo 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4 ore. Questo viene fatto con il trasferimento di 300 campioni microlitri di TAP-3% agar difco 60 × 15 tavole mm; punti 3-4 per piastra. Fare attenzione a non agitare la miscela di accoppiamento in quanto ciò potrebbe compromettere le coppie di accoppiamento. Agar Difco viene utilizzato perché ha un minor numero di contaminanti di agar a basso prezzo, e sarà più facile vedere zigoti sotto il microscopio.
La miscela di accoppiamento non utilizzati possono essere lasciati nel pallone durante la notte, e la qualità della reazione di accoppiamento sarà evidente il giorno successivo. Quando l'accoppiamento è efficiente, gli zigoti aderirà alla parete o al fondo del pallone ed il mezzo apparirà chiaro. Anche l'agitazione del pallone non riuscirà a rimuovere gli zigoti. Se attacca niente al vetro quando la miscela viene agitata con forza ragionevole, allora l'accoppiamento era inefficiente o non ha luogo. - Il TAP-difco piastre contenenti miscela di accoppiamento vengono essiccati in una cappa sterile, con le palpebre socchiuse, finchè tutto il liquido di superficie è stata assorbita. Le piastre sono in genere lasciati alla luce (700 NE / m 2 / sec) per 18 ore, poi avvolto in un foglio, dal momento che la maturazione zygospore avverrà solo al buio. I ceppi incrociati, l'accoppiamento ora e la data sono scritti su entrambi i piatti e la pellicola. Le piastre sono memorizzati 5 a 7 giorni e può essere conservato più a lungo, anche se l'efficienza germinazione zigote diminuisce progressivamente.
Parte 3: Dissection Tetrade
- Cellule vegetative dovrebbe essere raschiata macchie secche di miscela di accoppiamento con una lama poco affilata come un bisturi. La lama può essere utilizzata per esporre una superficie di zigoti, che si atterrà strettamente al agar 3%. Questo passo è di solito fatto nel pomeriggio, in modo che gli zigoti sono germinati dalla mattina successiva, ma non hanno subito un secondo, divisione vegetativo cherendimento dell'8 progenie. Chlamydomonas biologi imparano rapidamente a riconoscere zigoti sotto il microscopio, dal momento che sono più grandi delle cellule vegetative, e dispongono di uno spesso muro zygospore che dà un contorno nero. Zygospores spesso di colore giallo, ma può anche essere un po 'verde. Il personaggio più importante è che si attaccano di agar-agar, mentre le cellule vegetative sono facilmente spostati da parte. Tuttavia, se i piatti sono troppo secco questo non sarà il caso. Inoltre, se la miscela di accoppiamento era troppo denso, zigoti possono formare un tappeto che renderà il trasferimento di zigoti singoli difficile o impossibile. Densità appropriati sono stabiliti al punto 2.1, e sarà presto imparato con l'esperienza.
- Aghi di vetro sono preparati per la raccolta e la separazione zigoti progenie tetrade. Questi sono preparati tirando 3 canne di vetro mm in una piccola fiamma di generare un lungo filo sottile, che può essere interrotta. Le punte di questi fini conici vengono smussate o piegati in ganci, da riscaldamento breve in una fiamma bassa (ad esempio alcol o un fiammifero). Preparare 3 o più aghi di vetro, dal momento che si rompono abbastanza facilmente, soprattutto per gli utenti meno esperti.
- Zigoti sono riuniti il 3% TAP-difco placca utilizzando un ago di vetro in un mucchio di piccole dimensioni. Un quadrato di agar (fino a 0,5 cm 2) che contiene il zigoti è formato e asportato con un bisturi noioso. Poi, il blocco agar è posto a faccia in giù su un 15 mm 1,5% TAP-Difco piatto, e scivolò lungo una linea orizzontale di circa 1,5 cm dal bordo superiore della piastra, per distribuire gli zigoti. La linea orizzontale superiore e una griglia con circa 1,5 cm ai lati e 0,5 cm Distanza verticale sono incisi sul retro delle lastre. La griglia sarà utilizzato il giorno seguente come guida per separare la progenie tetrade (la griglia può anche essere inciso il giorno della dissezione). Infine, zigoti singoli passare alle intersezioni delle linee orizzontale superiore con ogni linea verticale, con circa 20-30 zigoti per piastra. Anche se solo 12 o giù di lì sarà sezionato, non ogni zigote germina, e alcuni si dividono due volte prima di scoppiare, zigoti così supplementari sono necessari.
- Dopo aver distribuito il zigoti, e le cellule vegetative che sono stati accidentalmente trasferito dalla piastra di agar 3% vengono uccisi esponendo la piastra capovolta per 30 secondi su un piatto di vetro contenente una sottile (1-2 mm) strato di cloroformio. La distanza tra la piastra ed il cloroformio dovrebbero essere di circa 5 cm. Se cloroformio viene usato troppo, o se la distanza è troppo piccolo o grande, si rischia di uccidere sia gli zigoti, o non uccidere le cellule vegetative. Il trattamento cloroformio deve essere fatta subito dopo la zygospores sono stati distribuiti sul piatto germinazione, per garantire la selettività.
- La germinazione dura 16-20 ore per la maggior parte dei ceppi, ma varia a seconda del genotipo e con l'età degli zigoti. Per la germinazione, le piastre sono posti sotto condizioni di scarsa luminosità (239 NE / m 2 / sec), o alla luce grigio medio, coprendo il piatto con un fazzoletto.
- Zigoti germinato possono essere identificati al microscopio le cellule gonfie o, a volte scoppio con cellule figlie al loro interno. Se il zygospore non è rotto, sfiorando con un ago di vetro si rompe il muro se germinazione si è verificato. Cellule figlie vengono delicatamente trascinato i punti di griglia sottostante lo zigote. E 'più facile per fare questo catturando la cella in una piccola quantità di liquido rilasciato dal agar dalla pressione del ago di vetro, e trascinando questa "pozzanghera" dietro l'ago. Una forma di "assicurazione" che si ha sezionato uno zigote e non una cellula vegetativa che ha diviso due volte, è che oltre alle cellule figlie quattro, la "pelle" del muro zygospore rimarrà.
- La progenie sezionato vengono coltivate in condizioni appropriate fino clonies visibili possono essere raccolti per successive analisi. Piastre devono essere monitorati ogni giorno per contaminazione.
Nota: Generazione di diploidi vegetativo non è coperto qui, ma coinvolge essenzialmente placcatura la miscela di accoppiamento a medio che non sosterrà la crescita di entrambi ceppo parentale, ma sosterrà la crescita del diploide (ad esempio due auxotropic marcatori diversi). Le piastre sono tenuti in luce per evitare la formazione di zigoti.
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Discussion
L'analisi genetica è semplice in Chlamydomonas, ma richiede particolari tecniche per generare gameti e progenie tetrade separati. Con ceppi sani, le tecniche sono facilmente acquisite. Con alcuni ceppi mutanti, diventa più un'arte, e si rimanda Volume 1 del Sourcebook, recentemente pubblicato Chlamydomonas per le note storiche e consigli pratici. Inoltre, va notato che ci sono molte variazioni sul tema di base sopra descritte, che vanno dal metodo per indurre gametogenesi, per il modello di distribuzione zigote e dissezione. In definitiva, ogni ricercatore scopre la loro zona di comfort, o adatta al laboratorio specifici protocolli.
Alcuni dettagli tecnici di cui sopra, deve essere ripetuta. In particolare, le cellule devono essere sane e senza alcuna infezione. E 'ben noto che in laboratorio adattato ceppi che non sono stati incrociati per un lungo periodo non può accoppiarsi bene, e la qualità dell'acqua può anche influenzare gametogenesi.
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Acknowledgments
Questo protocollo si basa su tecniche apprese nel laboratorio di Francesco-André Wollman presso l'Institut de Biologie fisico-Chimique, Parigi, Francia. Gli autori hanno un debito di gratitudine a Jacqueline Girard-Bascou, che ha originariamente introdotto DBS alle tecniche di Chlamydomonas genetica. Chlamydomonas di ricerca in laboratorio degli autori 'è supportato da premio della National Science Foundation MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
