Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Protein Ubikitinasyon Tespiti

doi: 10.3791/1293 Published: August 19, 2009

Summary

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri tarif

Abstract

Ubikitinasyon proteinleri hedef polipeptid ubikuitin, kovalent bağlanma, üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Ubikuitin-aktive edici enzim E1, ubikuitin-conjugating enzim E2 ve ubikuitin ligaz E3 içerir. E1 ve E2, E3 ubikuitin ligaz ekran substrat özgüllüğü aksine. Öte yandan, çok sayıda deubiquitylating enzimler polyubiquitinated proteinler işleme rolleri vardır. Ubikitinasyon protein istikrar, hücresel yerleşimi ve biyolojik aktivite değişikliği neden olabilir. Ubikuitinasyon / deubiquitination yolu veya değişmiş ubikuitin sistem işlev alan genlerin mutasyonlar, kanser, nörodejenerasyon ve metabolik bozukluklar gibi çeşitli türleri olarak çok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Hedef proteinlerin değişmiş veya normal ubikuitinasyon tespiti, bu hastalıkların patogenezi daha iyi anlaşılmasını sağlamak. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri tarif

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon Tespiti

  1. Protein ve ilgi (epitopu etiketli sürümü) ubikuitin ifade plazmid Transfect kültür hücreleri.
  2. Tam hücre lizis tamponu (% 2 SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 2mm sodyum orthovanadate, 50 mM sodyum florür, ve proteaz inhibitörleri ile.
  3. Plaka başına 100 ul hücre lizis tamponu (6 cm çanak) olan hücreler Lyse. Daha büyük bir çanak kullanılırsa, buna göre ses seviyesini ayarlayın. Swirl çanak lizis tamponu dikkatle yetiştirilen hücreler, tüm alanı kapsayacak.
  4. Bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve hücre lizatları 1,5 ml Eppendorf tüp içine aktarmak. Tüp 10 dakika kaynatın hemen sıcak bir tabağa yerleştirin.
  5. Kesme sonication cihaz ile hücreleri.
  6. 900ul seyreltme tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA,% 1 Triton) ekleyin. Rotasyon ile 30-60 dakika boyunca, 4 ° C'de örnek inkübe edin.
  7. 30 dakika 20.000 xg'de seyreltilmiş örnekleri Spin. Meydana gelen supernatant, yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.
  8. Protein konsantrasyonu ölçün.
  9. Protein A-veya G-agaroz boncuk-konjuge antikor (% 50 bulamaç) uyumlu bir tampon hedef proteinine karşı hazırlayın. P-200 pipet ucu dar ucu ve reçine 14-20 ul immunoprecipitation için hazırlanan hücre lizatları 500-1,500 mg aktarmak. Transfeksiyon verimliliği yüksek olan hücreler için, 500 mg yeterli olacaktır. Transfeksiyon verimliliği düşük olan hücreler için daha fazla proteine ​​ihtiyaç olabilir.
  10. 4 ° C gecede rotasyon ile hücre lizat-boncuk karışımı inkübe edin.
  11. 5 dakika için 5000 xg'de boncuk aşağı spin. Süpernatant aspire. Reçine yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40) iki kez yıkayın.
  12. Son bir kez 30 saniye süreyle 20.000 xg'de boncuk Spin. Artık yıkama tampon aspire ve 2X SDS yükleme tamponu ile reçine kaynatın.
  13. SDS-PAGE jel üzerine örnekler, analiz immunoblotting için yükleyin.
  14. Ubikuitin ve hedef protein antikorlar algılar. Immunoblotting için, genellikle ilk ubikuitin algılar. Membran protein çöktürülmüş algılamak için kullanılan olacak.

In vitro ubikuitinasyon tahlil yoluyla hedef protein ubikuitinasyon Tespiti

  1. 5X ubikuitinasyon tampon (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP) olun. 6 ay, -20 ° C'de küçük alikotları saklayın. Bazı protokoller de, ATP rejenerasyon 1,2 tampona kreatin fosfat ve kreatin kinaz ekleyin .
  2. Her reaksiyon için, aşağıdaki maddeleri içeren bir karışım hazırlayın:
    Ul 8 5X ubikuitinasyon tamponu
    250 ng ubikuitinasyon E1
    500 ng ubikuitinasyon E2
    0.5 mg ubikuitin
    0.5 mg ilgi protein
    40 ul toplam hacim su
    Kontrol grubu olarak benzer reaksiyonlar, E1, E2, ya da ubikuitin yokluğunda hazırlar.
  3. 1 saat veya daha uzun süre için 37 ° C karışımı inkübe edin.
  4. SDS-PAGE örnek tampon ekleyerek reaksiyon durdurun ve örnek 10 dakika kaynatın.
  5. SDS-PAGE jel üzerine örnekler, analiz immunoblotting için yükleyin.
  6. Ubikuitin ve hedef protein antikorlar algılar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu sunumda, öncelikle, kültürlü memeli hücrelerinde ilgi bir protein ubikuitin bir değişiklik olup olmadığını saptamak izin adımları nitelendirdi. Non-kovalent etkileşen proteinler üzerinde ilgi protein, özellikle ubikuitinasyon tespit etmek için, hücre parçalama, immunoprecipitation ve 1,3 yıkama için sıkı bir durum kullanılır. Bu nedenle, anti-ubikuitin immün böyle sert bir durumda hedef protein immunoprecipitation tarafından tespit Ubikitinasyon, hedef proteine ​​özgü olması muhtemeldir. Deneysel işlemleri sırasında protein deubiquitination önlemek için, N-ethylmaleimide ve ubikuitin aldehit gibi deubiquitinating enzim inhibitörleri Tüm tamponları 4 eklenebilir. Ancak, 10 dakika kaynar işlemden sonra aktif deubiquitination enzimleri kalması olası değildir. Güçlü lekelenme veya merdiven yüksek moleküler türlerin genellikle ubikuitinasyon sonucu. Ilgi protein ubikuitinasyon derecesi birkaç deney koşullarında ubiquitinated / değiştirilmemiş hedef protein oranı karşılaştırılarak tespit edilebilir. Bu arada, hedef protein ubikuitinasyon arttığında ücretsiz ubikuitin moleküller genellikle azalır. Bu protokol aynı zamanda sumolyation ve neddylation gibi diğer ubikuitin gibi küçük molekül değişikliği tespit etmek için yararlıdır.

Ayrıca arıtılmış veya rekombinant proteinleri kullanılarak in vitro ubikuitinasyon tayininde bir tarif. Çeşitli epitopu etiketli ubikuitinasyon bileşenleri ticari olarak kullanılabilir. Ubikitinasyon E3 ligaz in vitro ubikuitin konjugasyon için gerekli değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Rejeneratif Tıp hibe RS1-00331-1 için California Institute ve RL1-00.682-1 (Z Zhang); Amerikan Parkinson Bu çalışma NIH hibe RO1 DC006497, RO1 NS057289 ve PO1 ES016738 (Z. Zhang) tarafından desteklenmiştir. Hastalığı Derneği (Z. Zhang ve YS Choo) ve Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı (Z. Zhang).

References

  1. Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
  2. Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity. Cell. 118, 83-97 (2004).
  3. Didier, C. RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization. Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).
  4. Laney, J. D., Hochsetrasser, M. Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination. Current Protocols in Protein Science. 14.5.1-14.5.11 (2002).
Protein Ubikitinasyon Tespiti
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293, doi:10.3791/1293 (2009).More

Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293, doi:10.3791/1293 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter