是描述一个与环境基因组DNA经季节性缺氧峡湾的垂直深度连续分离的fosmid库建设。由此产生的克隆库回升到384孔板和存档,为下游的测序和一个自动化殖民地采摘系统的应用功能筛选。
微生物在自然界中的绝大多数,目前仍无法进入传统的种植方法。在过去的十年中,独立的文化环境基因组(<em>即</em>宏基因组)的方法已经出现,使研究人员的桥梁,通过直接从环境中捕获的土著微生物群落的遗传内容种植的差距。为此,尽管巧妙的实验室克隆技术,基因组DNA库使用标准。在这里,我们描述了与经季节性缺氧峡湾垂直深度连续的DNA插入一个大环境fosmid基因库的建设。该协议是直接挂钩的一系列连接的协议,包括沿海海水取样[1],微生物生物量大量过滤[2]和DNA提取和纯化协议[3]。首先,高品质的基因组DNA与创造的5 – 磷酸两端钝月底修复。最终修复DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)的大小选择和执行收回30至60万个碱基对的长度(KB)的DNA片段凝胶萃取。大小选择的DNA纯化远离PFGE凝胶基质和结扎磷酸酶治疗钝fosmid CopyControl载体pCC1(震中<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>)。 pCC1和插入DNA的线性concatemers随后headfull的lambda terminase包装成噬菌体颗粒,随后感染的抗噬菌体<em> E。大肠杆菌</em>细胞。抗生素的选择下,成功转染克隆LB琼脂平板上恢复和384孔板使用一个自动化的殖民地采摘机器人(Qpix2,GENETIX)的格式存档。目前的协议,吸引了来自各种来源,包括CopyControl Fosmid图书馆震中生产套件多个研究小组已经发表的作品[4-7]。每一步都是与心目中的最佳做法。只要有可能,我们强调在执行细微之处,以提高整体质量和图书馆的生产效率。 fosmid库生产和自动化殖民地采摘的整个过程至少需要7-10天,因为有很多孵化步骤包括。然而,有几个停车点可能是在协议中提到的。
一个过程描述了如何最有效地产生大插入fosmid从沿海水样的基因组DNA库。上游基因组DNA的提取是在一个单独的协议[3]。
由于fosmid库生产是一个多步骤的过程中,计划整个过程,包括提出的所有四个步骤的时间至少需要两到三个星期。基因组DNA的提取是最关键的一步,所有下游步骤依靠提取的基因组DNA的质量和数量;,所以考虑这一步花费足够的时间和工作细心。您提取的DNA的?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新,不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会(NSERC),加拿大的加拿大基金会。 MT与SL支持由图拉基金会资助中心微生物的多样性和进化(CMDE)的奖学金。吨,还收到了德意志研究联合会(DFG)的奖学金支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Step II | ||||
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
1.0X TAE running buffer | ||||
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
water bath | VWR | 14231-854 | ||
centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
Step III | ||||
LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
Step IV | ||||
96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
Difco Agar | BD | 214530 | ||
glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
QFill3 | Genetix | X3050 | ||
Bleach | Javex | |||
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |