מוות מבוססי תא assay עבור PTI בצמחים ניקוטיאנה benthamiana מתואר.
כדי לתפוס פתוגנים פוטנציאליים בסביבה שלהם, הצמחים להשתמש זיהוי תבניות קולטנים (PRRs) בהווה על ממברנות פלזמה שלהם. PRRs להכיר תכונות חיידקים נשמרת בשם הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) וגילוי זה מוביל חסינות PAMP-מופעלות (PTI), אשר למעשה מונע קולוניזציה של רקמות הצמח על ידי 1,2 שאינם פתוגנים. מערכת ביותר למד היטב PTI הוא 3 FLS2 תלוי מסלול. FLS2 מכירה flg22 PAMP כי הוא רכיב של flagellin חיידקי.
פתוגנים מצליחים להחזיק גורמים ארסיות או effectors שיכולים לדכא PTI ולאפשר הפתוגן לגרום למחלה 1. יש צמחים בעלי גנים להפוך התנגדות המאתרות effectors או הפעילות שלהם, מה שמוביל חסינות מפעיל-מופעלות (אתי) 2.
אנו מתארים מוות מבוססי תאים assay עבור PTI שונה מ הו ו Collmer 4. Assay היתה סטנדרטית ב נ benthamiana, אשר נמצא בשימוש יותר ויותר כמערכת מודל לחקר יחסי גומלין צמח פתוגן 5. PTI הוא המושרה על ידי חדירה של זן לא פתוגני חיידקי לתוך העלים. שבע שעות מאוחר יותר, זן חיידקי או מחלה או גורם אשר מפעילה אתי הוא הסתנן לאזור חופפות את אזור החדירה המקורי. PTI הנגרמת על ידי חדירת הראשון הוא מסוגל לעכב או למנוע את המראה של מוות של תאים עקב חדירת האתגר השני. לעומת זאת, את המראה של מוות של תאים באזור חופפים של חיסון מציין פירוט של PTI.
ארבעה שילובים שונים של מעוררים של PTI וכן חיסונים אתגר היו סטנדרטיים (טבלה 1). Assay נבדקה על אי – השתיק נ benthamiana צמחים ששימשו לשלוט וצמחים השתיק עבור FLS2 אשר נחזו להיות פגיעה ביכולתם לפתח PTI.
התא assay מוות מבוססי ניתן להשתמש כדי לקבוע את מעורבותם של גנים ב PTI. למשל, הפסד של פונקציה מוטציות של הגן של עניין, ניתן לבדוק באמצעות assay. מתוך 4 שילובים של inducer ו חיסונים אתגר נתון בטבלה 1, זה אפשרי, כי רק שילוב אחד עלול לגרום פנוטיפ ברקע המפעל שלך. ראינו כי הצמחים השתיק עבור FLS2 להראות פירוט של PTI ב PF / DC ו Pf/Q1-1 שילובים של inducer ו חיסונים אתגר (טבלה 1).
זה חיוני כי התנאים הסביבתיים עבור assay הם קרוב ככל האפשר לאלה המתוארים בפרק 3.1. לחות נמוכה גורמת למוות התא להתקדם מהר מדי, מה שהופך assay קשה להבקיע. אם התנאים המתוארים בפרוטוקול שלנו לא עובדים במעבדה שלך, ואז לנסות לשנות את רמת inducer או חיסון אתגר. פרמטר נוסף אשר יכול להיות שונה הוא פער הזמן בין אינדוקציה אתגר, אם כי מצאנו כי פערי זמן קצר גרם assay להישבר מהר מדי בצמחים שליטה.
אנו ממליצים כי לפחות 4-5 צמחים להיבדק בניסוי לבין פנוטיפ חיובית יש לחזור לפחות ניסויים עצמאיים 3-4.
אנו מודים היאה-סוק הו, ג'ואן מורלו ואלן Collmer, המחלקה הצמח פתולוגיה הצמח-Microbe לביולוגיה, אוניברסיטת קורנל, לדיונים חשובים. אנו מודים ג'סי Munkvold הערות על המאמר. המימון ניתן על ידי תוכנית הקרן הלאומית למדע הגנום הצמח, מספר פרס DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |