Гибель клеток основе анализа для ПТИ в Nicotiana растений benthamiana описано.
Воспринимать потенциально патогенных микроорганизмов в окружающей их средой, растения используют распознавания образов рецепторы (РРСС), присутствующих на их мембранах плазмы. PRRS признать сохраняется микробной функции называются патоген-связанные молекулярные модели (PAMPs), и это приводит к обнаружению PAMP-срабатывает иммунитет (ПТИ), который эффективно предотвращает колонизацию тканей растений, не являющихся возбудителями 1,2. Наиболее хорошо изучена система в ПТИ является FLS2-зависимого пути 3. FLS2 признает PAMP flg22, являющийся компонентом бактериальной флагеллин.
Успешное возбудителей обладают факторы вирулентности или эффекторами, которые могут подавлять PTI и позволяют возбудителя вызывают заболевания 1. Некоторые растения, в свою очередь обладают гены устойчивости, которые обнаруживают эффекторов или их деятельность, что приводит к эффектор-срабатывает иммунитет (ETI) 2.
Мы описываем гибели клеток основе анализа для PTI редактировался Ох, и Collmer 4. Анализ был стандартизован в Н. benthamiana, которые все более широко используется в качестве модельной системы для изучения растительного патогена взаимодействия 5. PTI индуцировано проникновение непатогенных бактериального штамма в листья. Семь часов спустя, бактериальный штамм, который либо вызывает болезнь, которая активирует или ETI проникли в зону перекрытия первоначальной зоны инфильтрации. PTI индуцированных первого проникновения может задержать или предотвратить появление клеточной смерти из-за второго инфильтрации вызов. С другой стороны, появление гибель клеток в области перекрытия прививки указывает распада PTI.
Четыре различных комбинаций индукторов PTI и бросить вызов прививки были стандартизированы (табл. 1). Анализ был проверен на не замолчать Н. benthamiana растений, которые служили в качестве контроля и растений замолчать для FLS2, что, согласно прогнозам, будет скомпрометирована в их способности развивать PTI.
Гибель клеток основе анализа могут быть использованы для определения участия гена в ФТИ. Так, например, с потерей функции мутантов гена могут быть проверены с помощью этого теста. Из 4 комбинации индуктор и проблема прививок приведены в таблице 1, не исключено, что только одна комбинация может привести к фенотипу на Вашем предприятии фоне. Мы заметили, что растения замолчать для FLS2 показать распад ПТИ в Р / DC и Pf/Q1-1 комбинации индуктор и проблема прививок (табл. 1).
Очень важно, чтобы условия окружающей среды для анализа являются как можно ближе к описанным в части 3.1. Низкая влажность причины гибели клеток приступить слишком быстро, что делает анализ трудно забить. Если условия, описанные в наш протокол не работает в вашей лаборатории, то попробуйте изменить уровень индуктор или поставить под сомнение прививки. Другой параметр, который может быть изменен является разрыв во времени между индукцией и проблемы, хотя мы обнаружили, что более короткие временные промежутки вызвало анализа, чтобы сломать слишком быстро в контрольных растений.
Мы рекомендуем, чтобы по крайней мере 4-5 растений быть проверены в эксперименте и положительного фенотипа следует повторять по меньшей мере в 3-4 независимых экспериментов.
Мы благодарим Хе Сук Ох, Джоан Морелло и Алан Collmer, Департамент по патологии растений и растительно-микробных биологии Корнельского университета, за ценные обсуждения. Мы благодарим Джесси Munkvold для комментариев к статье. Финансирование было предоставлено Национальный научный фонд Программа Геном завод, награда число DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |