Ein Zelltod-basierter Assay für PTI in Nicotiana benthamiana Pflanzen beschrieben.
Um wahrnehmen potenzielle Krankheitserreger in ihrer Umwelt, verwenden Pflanzen pattern recognition receptors (PRR), die auf ihrer Plasmamembran. PRRs erkennen konservierte mikrobielle Eigenschaften genannt pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und diese Erkennung führt zu PAMP ausgelöste Immunität (PTI), das verhindert, Kolonisierung Pflanzengewebe durch Nicht-Erreger 1,2. Die gut untersuchte System in PTI ist die FLS2-abhängige Pfad 3. FLS2 erkennt die PAMP flg22, dass eine Komponente des bakteriellen Flagellin ist.
Erfolgreiche Krankheitserreger besitzen Virulenzfaktoren oder Effektoren, die PTI unterdrücken und damit die Erreger Krankheit 1 führen kann. Einige Pflanzen wiederum besitzen Resistenzgene, die Effektoren oder ihre Tätigkeit, die Effektor-triggered Immunität (ETI) 2 führt zu erkennen.
Wir beschreiben ein Zelltod-basierter Assay für PTI von Oh und Collmer 4 modifiziert. Der Assay wurde standardisiert in N. benthamiana, die verwendet wird zunehmend als ein Modellsystem für die Untersuchung von Pflanzen-Pathogen Interaktionen 5. PTI ist durch Infiltration eines nicht-pathogenen Bakterienstamm in den Blättern. Sieben Stunden später, ein Bakterienstamm, der entweder krank macht oder welche aktiviert ETI in einen Bereich ohne Zwischenraum über die ursprüngliche Infiltration Zone infiltriert. PTI vom ersten Infiltration induziert der Lage ist, verzögern oder verhindern das Auftreten von Zelltod durch die zweite Herausforderung Infiltration. Umgekehrt zeigt das Aussehen des Zelltods in den überlappenden Bereich der Impfung eine Aufschlüsselung der PTI.
Vier verschiedene Kombinationen von Induktoren von PTI und Herausforderung Impfungen wurden standardisiert (Tabelle 1). Der Test wurde auf Nicht-Schweigen N. getestet benthamiana Pflanzen, wie die Kontrolle und Anlagen für FLS2 zum Schweigen, die voraussichtlich in ihrer Fähigkeit, PTI entwickeln beeinträchtigt werden serviert wurden.
Das Zelltod-basierte Test kann verwendet werden, um die Beteiligung eines Gens in PTI bestimmen. Zum Beispiel kann loss-of-function-Mutanten für ein Gen von Interesse unter Verwendung dieses Tests sein. Von den 4 Kombinationen von Induktor und Herausforderung Impfungen in Tabelle 1 angegeben, ist es möglich, dass nur eine Kombination kann in einem Phänotyp in Ihrer Anlage Hintergrund führen. Wir haben beobachtet, dass Pflanzen für FLS2 Schweigen eine Aufschlüsselung der PTI in der Pf / DC und Pf/Q1-1 Kombinationen von Induktor und Herausforderung Impfungen (Tabelle 1) zeigen.
Es ist wichtig, dass die ökologischen Bedingungen für die Tests sind so nah wie möglich an die in Teil 3.1 beschrieben. Zu trockene Luft führt zum Zelltod, zu schnell zu fahren, so dass der Test nur schwer zu punkten. Wenn die Bedingungen in unserem Protokoll beschrieben werden, nicht in Ihrem Labor funktionieren, dann versuchen Sie die Änderung der Höhe der Induktor oder Herausforderung Impfung. Ein weiterer Parameter, die geändert werden können, ist die zeitliche Lücke zwischen Induktion und der Provokation, obwohl wir festgestellt, dass kürzere Zeitabstände der Test zu brechen zu schnell unter Kontrolle Pflanzen verursacht haben.
Wir empfehlen, dass mindestens 4-5 Pflanzen in einem Experiment getestet werden und eine positive Phänotyp sollte mindestens 3-4 unabhängigen Experimenten wiederholt werden.
Wir danken Hye-Sook Oh, Joanne Morello und Alan Collmer, Department of Plant Pathology und Pflanzen-Mikroben-Biologie, Cornell University, für wertvolle Diskussionen. Wir danken Jesse Munkvold für Kommentare zu diesem Artikel. Die Finanzierung wurde von der National Science Foundation Pflanzengenom-Programm bereitgestellt, Vergabe-Nummer DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |