A la mort cellulaire à base d'analyse pour PTI dans les plantes de Nicotiana benthamiana est décrite.
Pour percevoir des agents pathogènes potentiels dans leur environnement, les plantes utilisent Pattern Recognition Receptors (PRR) présents sur leurs membranes plasmiques. PRR reconnaître les caractéristiques microbiennes conservées appelé pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) et cela conduit à la détection PAMP déclenché par l'immunité (PTI), qui empêche efficacement la colonisation des tissus de la plante par des non-pathogènes 1,2. Le système le plus étudié dans PTI est le 3 voie FLS2-dépendante. FLS2 reconnaît le flg22 PAMP qui est une composante de la flagelline bactérienne.
Pathogènes réussissent possèdent des facteurs de virulence ou des effecteurs qui peuvent supprimer PTI et permettre à l'agent pathogène à causer la maladie 1. Certaines plantes possèdent à leur tour des gènes de résistance qui permettent de détecter des effecteurs ou leur activité, ce qui conduit à effecteur déclenché par l'immunité (ETI) 2.
Nous décrivons une mort cellulaire à base d'analyse pour PTI modifié depuis Oh et Collmer 4. Le test a été normalisé en N. benthamiana, qui est en plus utilisées comme un système modèle pour l'étude des interactions plante-pathogène 5. PTI est induite par l'infiltration d'une souche non pathogène bactérien dans les feuilles. Sept heures plus tard, une souche bactérienne qui cause la maladie ou qui actionne ETI est infiltré dans une zone de chevauchement de la zone d'infiltration d'origine. PTI induite par l'infiltration premier est capable de retarder ou d'empêcher l'apparition de la mort cellulaire due à l'infiltration deuxième défi. Inversement, l'apparition de la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'inoculation indique une panne de PTI.
Quatre combinaisons différentes avec des inducteurs du PTI et inoculations défi ont été normalisées (tableau 1). Le dosage a été testé sur la non-taire N. benthamiana qui a servi de contrôle et de silence pour les plantes qui ont été prédites FLS2 d'être compromises dans leur capacité à développer PTI.
Dosage de la mort basée sur la cellule peut être utilisée pour déterminer l'implication d'un gène dans le PTI. Par exemple, la perte de fonction des mutants pour un gène d'intérêt peut être testée en utilisant ce dosage. Sur les quatre combinaisons d'inducteur et inoculations défi, étant donné dans le tableau 1, il est possible que seule une combinaison peut entraîner un phénotype dans votre fond végétal. Nous avons observé que les plantes réduit au silence pour FLS2 montrent une répartition de PTI dans le Pf / DC et des combinaisons de Pf/Q1-1 inducteur et inoculations défi (tableau 1).
Il est essentiel que les conditions environnementales pour le dosage sont aussi proches que possible de celles décrites dans la partie 3.1. Faible taux d'humidité provoque la mort cellulaire de procéder trop rapidement, ce qui rend le dosage difficile de marquer. Si les conditions décrites dans notre protocole ne fonctionne pas dans votre laboratoire, alors essayez de modifier le niveau d'inducteur ou d'inoculation d'épreuve. Un autre paramètre qui peut être modifié, c'est l'écart de temps entre l'induction et le défi, mais nous avons constaté que les écarts de temps plus courte causé le dosage de briser trop rapidement dans les plantes de contrôle.
Nous recommandons que au moins 4-5 plantes être testée dans une expérience et un phénotype positif doit être répété dans au moins 3-4 expériences indépendantes.
Nous remercions Hye-Sook Oh, Joanne Morello et Alan Collmer, Département de pathologie végétale et plante-microbe Biologie, Université Cornell, à des discussions utiles. Nous remercions Jesse Munkvold des commentaires sur l'article. Le financement a été fourni par le Programme National Science Foundation génome des plantes, le nombre récompense DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |