Una morte saggio basato su cellule di PTI in piante di Nicotiana benthamiana è descritto.
Percepire potenziali patogeni nel loro ambiente, le piante usano recettori pattern recognition (PRR) presenti sulla loro membrana plasmatica. PRR riconoscere caratteristiche microbiche conservato chiamato pattern molecolare patogeni associati (PAMPs) e questo porta alla rilevazione PAMP-triggered immunità (PTI), che previene efficacemente la colonizzazione dei tessuti vegetali da parte di non-patogeni 1,2. Il sistema più ben studiata nel PTI è il FLS2-dipendente 3 percorso. FLS2 riconosce il flg22 PAMP che è un componente di flagellina batterica.
Agenti patogeni di successo possiedono fattori di virulenza o effettori che possono sopprimere PTI e permettere al patogeno di causare malattie 1. Alcune piante, a loro volta in possesso di geni di resistenza che rilevano effettori o la loro attività, che porta a effettrici-triggered immunità (ETI) 2.
Descriviamo una morte saggio basato su cellule di PTI modificato da Oh e Collmer 4. Il test è stato standardizzato in N. benthamiana, che viene utilizzato sempre più come sistema modello per lo studio delle interazioni pianta-patogeno 5. PTI è indotta da infiltrazione di un non-patogeno ceppo batterico in foglie. Sette ore dopo, un ceppo batterico che causa la malattia sia o che attiva ETI è infiltrato in una zona di sovrapposizione la zona di infiltrazione originale. PTI indotta dalla infiltrazione prima è in grado di ritardare o impedire la comparsa di morte cellulare a causa delle infiltrazioni seconda sfida. Al contrario, l'aspetto della morte cellulare nella zona di sovrapposizione di inoculazione indica la ripartizione dei PTI.
Quattro diverse combinazioni di induttori del PTI e vaccinazioni sfida sono stati standardizzati (Tabella 1). Il test è stato testato in materia di non tacere N. piante benthamiana che serviva come il controllo e le piante a tacere per FLS2 che sembravano destinate a essere compromessi nella loro capacità di sviluppare PTI.
Morte a base della cellula test può essere usato per determinare il coinvolgimento di un gene nel PTI. Per esempio, la perdita di funzione mutanti per un gene di interesse può essere provata da questo test. Dei 4 combinazioni di induttore e inoculazioni sfida riportati nella tabella 1, è possibile che una sola combinazione può causare un fenotipo in fondo dell'impianto. Abbiamo osservato che le piante a tacere per FLS2 mostrano una ripartizione del PTI nel Pf / DC e Pf/Q1-1 combinazioni di induttore e vaccinazioni sfida (tabella 1).
E 'essenziale che le condizioni ambientali per il saggio sono il più vicino possibile a quelli descritti nella Parte 3.1. Bassa umidità provoca la morte cellulare per procedere troppo velocemente, rendendo difficile il test di segnare. Se le condizioni descritte nel nostro protocollo non lavorano nel vostro laboratorio, poi provare a modificare il livello di induttore o inoculazione sfida. Un altro parametro che può essere modificato è il divario di tempo tra induzione e di sfida, anche se abbiamo trovato che le lacune più breve tempo ha causato il saggio di abbattere troppo in fretta negli impianti di controllo.
Si consiglia di almeno 4-5 impianti essere testato in un esperimento e un fenotipo positivo deve essere ripetuto in almeno 3-4 esperimenti indipendenti.
Ringraziamo Hye-Sook Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Dipartimento di Patologia Vegetale e Plant-Microbe Biologia, Cornell University, per le discussioni importanti. Ringraziamo Jesse Munkvold per commenti su questo articolo. Il finanziamento è stato fornito dal Programma Nazionale Genoma Plant Science Foundation, il numero di riconoscimento DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |