Una célula de la muerte de ensayo basado en la PTI en plantas de Nicotiana benthamiana se describe.
Para percibir los patógenos potenciales en su entorno, las plantas utilizan receptores de reconocimiento de patrones (RRP) presentes en su membrana plasmática. PRR reconoce conserva las características microbianas llamado patógeno patrones moleculares asociados (PAMP) y esto lleva a la detección de PAMP disparado por la inmunidad (PTI), lo que efectivamente previene la colonización de los tejidos de la planta por no patógenos 1,2. El sistema más estudiado bien en PTI es la vía 3 FLS2-dependiente. FLS2 reconoce la flg22 PAMP que es un componente de la flagelina bacteriana.
Patógenos éxito poseen factores de virulencia o efectores que pueden suprimir la PTI y permitir que el patógeno que causa la enfermedad 1. Algunas plantas, a su vez poseen los genes de resistencia que detectan los efectores o su actividad, lo que lleva a efectores activados por la inmunidad (ETI) 2.
Se describe una celda de la muerte de ensayo basado en la PTI modificado a partir de Oh y Collmer 4. El ensayo fue estandarizado en el N. benthamiana, que se está utilizando cada vez más como un sistema modelo para el estudio de las interacciones planta-patógeno 5. PTI es inducida por la infiltración de una cepa no patógena de bacterias en las hojas. Siete horas después, una cepa bacteriana que causa la enfermedad o bien que se activa la ETI se infiltra en una zona de solapamiento de la zona de infiltración original. PTI inducida por la primera infiltración es capaz de retrasar o prevenir la aparición de la muerte celular debido a la infiltración segundo desafío. Por el contrario, la aparición de la muerte celular en la zona de solapamiento de la inoculación indica el desglose de PTI.
Cuatro combinaciones diferentes de los inductores del PTI y las inoculaciones desafío fueron estandarizadas (Tabla 1). El ensayo fue probado en no callar N. benthamiana plantas que sirvieron de control y las plantas de silencio para FLS2 que se prevé que se compromete en su capacidad de desarrollar PTI.
Ensayo de la muerte de la célula-basado puede ser utilizada para determinar la participación de un gen en el PTI. Por ejemplo, la pérdida de función de mutantes de un gen de interés se puede probar mediante este ensayo. De las cuatro combinaciones de inductor e inoculaciones desafío en la Tabla 1, es posible que sólo una combinación puede resultar en un fenotipo en el fondo de la planta. Hemos observado que las plantas silenciadas por FLS2 muestran un desglose del PTI en el Pf / DC y Pf/Q1-1 combinaciones de inductor e inoculaciones desafío (Tabla 1).
Es esencial que las condiciones ambientales para el ensayo son lo más cercano posible a los descritos en la parte 3.1. La baja humedad provoca la muerte celular de proceder con demasiada rapidez, haciendo que el ensayo de difícil calificación. Si las condiciones descritas en el protocolo de no trabajar en su laboratorio, y luego tratar de alterar el nivel de inductor o inoculación de desafío. Otro parámetro que se puede modificar es el intervalo de tiempo entre la inducción y la provocación, aunque se ha encontrado que más cortos intervalos de tiempo causó que el ensayo se descomponen muy rápidamente en las plantas de control.
Le recomendamos que por lo menos 4-5 plantas a prueba en un experimento y un fenotipo positivo se debe repetir por lo menos en experimentos independientes 3-4.
Damos las gracias a Hye Sook-Oh, Morello Joanne y Alan Collmer, Departamento de Patología Vegetal y Biología de las Plantas-Microbios, la Universidad de Cornell, valiosa para los debates. Damos las gracias a Jesse Munkvold comentarios sobre el artículo. El financiamiento fue proporcionado por el Programa Nacional de Ciencia Fundación Genoma Vegetal, el número de premios DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |