Summary
तंत्रिका सर्किट को नियंत्रित करने और विश्लेषण
Protocol
1. Stereotaxic दबाना का निर्माण
- stereotaxic दबाना stereotax इंजेक्टर सरणी संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ताकि injectors stereotaxic हाथ करने के लिए समानांतर हैं.
- प्रत्येक प्रयोगशाला केवल एक घोड़े का अंसबंध की जरूरत है, जब तक यह अनुमान है कि एक से अधिक सर्जरी जगह एक साथ ले सकता है. इस मामले में, एक साथ सर्जरी के प्रत्याशित अधिकतम संख्या के रूप में एक ही नंबर बनाते हैं. यह भी एक अतिरिक्त बनाने के लिए पहले से नुकसान के मामले में उचित हो सकता है.
- Stereotaxic दबाना बनाने के लिए, सबसे पहले, एक 1.5 मिमी की बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) इस्पात प्रवेशनी लंबाई में 2 इंच काट रहा है, और एक छोर नीचे फ्लैट जब तक Dremeled है.
- अगले, एक छोटा सा टुकड़ा (लगभग 0.5 x 0.5 सेमी) आद्य बोर्ड पीसीबी के बाहर काट रहा है, एक स्पेसर के रूप में इस्तेमाल किया जा.
- एक लेज़र कटर का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि किसी भी बना कटौती की सामग्री की सतह के लिए सीधा कर रहे हैं, दो समान आयत (1 / 2 "x 3 / 8") 1 / 8 "ऐक्रेलिक चादर का कपड़ा, प्रत्येक में दो गोल छेद होने आयत से काट रहे हैं आयत के विपरीत कोनों पहले छेद 1.5mm व्यास है, और बस काफी बड़े धातु प्रवेशनी कसकर पकड़ दूसरी छेद 1 / 16 व्यास "(चित्रा 1C) है..
- धातु प्रवेशनी एक आयत के 1.5 मिमी छेद में डाला जाता है, तो दूसरे की 1.5 मिमी छेद के माध्यम से. प्रवेशनी के नीचे अंत नीचे आयत के निचले चेहरे के साथ गठबंधन किया है, एक हॉकी स्टिक के आकार के गठन.
- जबकि कस दो आयतों के बीच आयोजित स्पेसर रखने, इस संरचना के साथ प्रवेशनी और 1.5mm छेद के आसपास गर्म गोंद का उपयोग करके एकजुट है, gluing आयत करने के लिए स्पेसर से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है. मॉडलिंग मिट्टी चीजों को इस प्रक्रिया के दौरान एक साथ पकड़ के लिए उपयोगी हो सकता है.
- गोंद के बाद सूख गया है, एक 1-72 पेंच आयतों के ऊपर की ओर से 1 / 16 छेद में डाला जाता है. फिर 1-72 हेक्स अखरोट 1-72 पेंच के अंत पर खराब कर दिया है है, और कड़ा. पेंच और अखरोट दबाना साथ पकड़ में सेवा करते हैं.
- हेक्स अखरोट के किनारे के आसपास से नीचे आयत, 5 मिनट epoxy की छोटी मात्रा के नीचे सामना करने के लिए हेक्स अखरोट देते गिरा रहे हैं epoxy हेक्स अखरोट या स्क्रू के धागे में प्राप्त करने की अनुमति के बिना. किसी भी क्ले मॉडलिंग, हटा दिया है और यह पुष्टि की है कि स्पेसर पेंच कस द्वारा जगह में मजबूती से आयोजित किया जा सकता है.
2. हैमिल्टन पंप और stereotax: अनुकूलित इंजेक्टर सरणी के लिए सिस्टम तैयारी
- सुई लगानेवाला सरणी प्रणाली मस्तिष्क में निर्देशांक के लगभग किसी भी सेट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
- उपयोगकर्ता पहली रेखांकित माउस (या अन्य प्रजातियों) मस्तिष्क एटलस में वांछित इंजेक्शन साइटों के निर्देशांक, उपयुक्त stereotax द्वारा इस्तेमाल निर्देशांक के लिए परिवर्तित (यहाँ, एक्स, वाई, और z-निर्देशांक). इंजेक्शन साइटों की संख्या (तीन आंकड़े 1A और 1B में) इसके बाद कश्मीर बुलाया जाएगा.
- 10 μl हैमिल्टन सीरिंज के k संख्या एक इंजेक्शन / वापसी जैसे हार्वर्ड तंत्र से यह एक सिरिंज पंप में रखा जाता है.
- आगे, polyethylene टयूबिंग 3 फुट लंबे टुकड़े सुरक्षित रूप से प्रत्येक हैमिल्टन सिरिंज की सुई से जुड़ी हैं.
- Polyethylene टयूबिंग, एक एफ 252 Upchurch वैज्ञानिक से टयूबिंग आस्तीन के प्रत्येक टुकड़ा के लिए खुले अंत से अधिक गिरावट है और एक पी 627 टयूबिंग शामिल अखरोट का उपयोग एडाप्टर से जुड़ी है और सामी, Upchurch वैज्ञानिक से भी.
3. स्वनिर्धारित इंजेक्टर ऐरे निर्माण
- प्रत्येक सुई लगानेवाला सरणी निर्देशांक है कि उपयोगकर्ता चुनता सेट करने के लिए अनुकूलित किया गया है. हालांकि, निर्देशांक है कि अनुवाद और / या केवल रोटेशन द्वारा अलग सेट के लिए, एक ही सुई लगानेवाला सरणी का इस्तेमाल किया जा सकता है.
- केवल रिश्तेदार एक्स और इंजेक्शन साइटों की वाई निर्देशांक को ध्यान में रखते हुए, कश्मीर छेद 1 / 32 मोटाई के एक पीसीबी आद्य बोर्ड में drilled कर रहे हैं ", वही रिश्तेदार रिक्ति के साथ इन छेद Modela मिनी मिल और एक .011 का उपयोग करने के लिए drilled हैं. " व्यास McMaster-Carr से ड्रिल बिट. ड्रिलिंग की एक धीमी दर (Z गति) का उपयोग करने के लिए तोड़ने या ड्रिल बिट पहनने से बचने के लिए सुनिश्चित करें. मिल से बोर्ड को हटाने से पहले, एक आयत छोटे छेद के आसपास drilled है, 1 / 32 व्यास "के एक बड़े ड्रिल बिट का उपयोग करते हुए, छोटे से एक पहनने से बचने के मिनी मिल के लिए कोड आसानी से MATLAB का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, नमूना कोड के निम्नलिखित फ़ाइलों में प्रदान की जाती है.
- - generate.m वांछित निर्देशांक से Modela कोड उत्पन्न करने के लिए MATLAB कोड
- holes_ex.rml - Modela ड्रिलिंग आद्य बोर्ड में अंगूठी पैटर्न (आठ छेद) के लिए कोड
- outline_ex.rml - ड्रिलिंग छेद के आसपास आयत के लिए Modela कोड
- 245 सुक्ष्ममापी OD/100 भीतरी व्यास (ID) जुड़े सिलिका केशिका टयूबिंग, Polymicro टेक्नोलॉजीज से उपलब्ध सुक्ष्ममापी 3 इंच के टुकड़ों के k संख्या में कटौती है. ये व्यक्ति injectors शामिल है. केशिका टयूबिंग की एक डिस्पोजेबल टुकड़ा के माध्यम से poked हैछेद में से प्रत्येक, दूर स्पष्ट करने के लिए वास्तविक injectors clogging बिना मलबे. injectors फिर प्रत्येक छेद में आधे रास्ते डाला है, इसलिए कि वे कसकर और समानांतर एक दूसरे से आयोजित कर रहे हैं. injectors बोर्ड epoxied हैं, सुई लगानेवाला सरणी की संरचना बनाने. सब कि रहता है सही लंबाई injectors ट्रिम है.
- इंजेक्टर सरणी एक्रिलिक आयतों के बीच आद्य बोर्ड के एक कोने में रखकर stereotaxic दबाना संलग्न है, और तब stereotaxic क्लैंप के पेंच कस द्वारा. अगला, क्लैंप के धातु प्रवेशनी stereotax संलग्न है stereotax की कुर्की तंत्र का उपयोग कर.
- निम्न में से एक खुर्दबीन के नीचे किया जाता है. एक बाहरी injectors (है कि, एक है कि एक सीधे बढ़त के साथ की ओर से संपर्क किया जा सकता है अन्य injectors में से किसी में bumping के बिना) के लिए, आद्य बोर्ड के नीचे से परे का विस्तार टिप कैंची से काट रहा है. Cortical इंजेक्शन के लिए, यह उचित है कि सुई लगानेवाला आद्य बोर्ड की सतह से परे लगभग 5mm विस्तार है. गहरी इंजेक्शन के लिए, इस संख्या में गहराई में इसी वृद्धि की वृद्धि हुई किया जा सकता है है. टिप एक Dremel उपकरण के साथ चपटा है. इंजेक्टर सुझावों को भी clogging के खिलाफ एक अतिरिक्त एहतियात के रूप में एक कोण पर जमीन किया जा सकता है, अगर गहराई में सटीक कम महत्वपूर्ण है.
- अगला, stereotaxic हाथ की सीमा के भीतर एक स्थिर संदर्भ बिंदु चुना जाता है, और सुई लगानेवाला सरणी ले जाया जाता है कि बाहरी सुई लगानेवाला के चपटा टिप, इस संदर्भ बिंदु पर है.
- एक दूसरे सुई लगानेवाला, अपनी इसी निर्देशांक के साथ चुना है. ऊंचाई में रिश्तेदार पहली और दूसरी निर्देशांक सुई लगानेवाला के बीच अंतर (z दिशा) माना जाता है. सुई लगानेवाला सरणी Z अक्ष के साथ इस रिश्तेदार दूरी के द्वारा ले जाया जाता है. दूसरा इंजेक्टर छंटनी की है और सही लंबाई Dremeled, ताकि दूसरा सुई लगानेवाला की नोक अब संदर्भ बिंदु की ऊंचाई पर फ्लैट है और. इंजेक्टर सरणी एक्स और वाई दिशाओं में ले जाया जा सकता है के लिए संदर्भ बिंदु के साथ सुई लगानेवाला टिप की तुलना की सुविधा है.
- Trimming के शेष injectors के लिए इस प्रक्रिया को दोहराया है.
4. कोडांतरण पूरे सिस्टम
- stereotaxic दबाना और दोनों पहले से ही निर्माण अनुकूलित सुई लगानेवाला, सरणी इस भाग के लिए आवश्यक हैं.
- प्रत्येक सुई लगानेवाला के पीछे के अंत (अंत है कि छंटनी नहीं किया गया है) एक F-240 टयूबिंग आस्तीन नीले और पी 235 नट और Upchurch वैज्ञानिक से P-200 सामी का उपयोग में डाला जाता है, लड़ी पिरोया adapter करने के लिए पहले से ही जुड़ा संलग्न है पॉलीथीन टयूबिंग द्वारा हैमिल्टन पंप करने के लिए. निर्माता के निर्देशों के विवरण के लिए परामर्श किया जा सकता है है.
- एक 27 गेज सुई का प्रयोग, सिलिकॉन तेल हैमिल्टन सीरिंज के पीछे इतना है कि पूरे सिस्टम हैमिल्टन सिरिंज से सुई लगानेवाला टिप से भरा है में अंतःक्षिप्त है सब पर कोई हवाई बुलबुले के साथ है.
- के रूप में हैमिल्टन सीरिंज हैमिल्टन पंप में रखा, सिलिकॉन तेल का सबसे बड़ा संभव मात्रा सीरिंज में बनाए रखा है.
- यदि प्रयोग अधिक सीरिंज से पंप के लिए (इस मामले में दो) बनाया गया है की आवश्यकता है, सीरिंज में प्लास्टिक के छोटे टुकड़े (जैसे, सुई टोपियां) के साथ दूरी पर हो सकते हैं और उन्हें एक दूसरे के समानांतर रखने के लिए, और सुनिश्चित करें कि सभी टुकड़े कर रहे हैं उसी हद तक पंप से धक्का दे दिया. या, एक रैक बहु उन्नयन किट हार्वर्ड उपकरण से खरीदा जा 10 सीरिंज के लिए एक ही बार में पकड़ कर सकते हैं.
5. / इंजेक्शन सर्जरी
- एक समानांतर सुई लगानेवाला के साथ इंजेक्शन की प्रक्रिया बहुत एक एकल विंदुक के साथ इंजेक्शन के समान है.
- यह धीमी गति से फिर से भरना का उपयोग करने के लिए / इस प्रक्रिया के दौरान दरों को बढ़ावा, आवश्यक है क्योंकि तेजी से पंप बड़े और छोटे टयूबिंग के बीच संयुक्त पर तनाव डाल सकता है. अनुशंसित अधिकतम दर: 2 / μl वायरस लोड हो रहा है के लिए मिनट और 0.1 μl / वायरस infusing के लिए मिनट.
- एक anesthetized माउस stereotax में रखा है, और प्रयोग भर anesthetized रहता है.
- तैयार माउस के रूप में की जरूरत है. उदाहरण के लिए, एक स्केलपेल के साथ, एक एकल कटौती नीचे त्वचा के midline किया जाता है आंखों के बीच से कान के बीच. त्वचा वापस खींच लिया है खोपड़ी बेनकाब, और प्रावरणी बंद साफ है. एक खींच कांच विंदुक stereotax से जुड़ी है. कान सलाखों के पदों bregma और लैम्ब्डा जब तक एक ही ऊंचाई के लिए गठबंधन कर रहे हैं, और इसलिए उन्हें जोड़ने के लिए लाइन stereotax के Y-अक्ष समानांतर है कि समायोजित कर रहे हैं. stereotax के अक्षों समन्वय प्रणाली में जो इंजेक्शन निर्देशांक गणना की गई है के अनुसार उन्मुख होते हैं. stereotaxic bregma ग्लास विंदुक टिप के साथ चुना है, और फिर टिप खोपड़ी से थोड़ा ऊपर एक्स और Y-निर्देशांक एक इंजेक्शन साइटों की के पर तैनात है.
- एक दंत ड्रिल का प्रयोग, टिप नीचे खोपड़ी ध्यान दूर मुकाबले जब तक वहाँ की हड्डी का एक अत्यंत पतली परत बनी हुई है. कांच विंदुक कम किया जा सकता हैएड और जाँच करें कि छेद drilled किया जा रहा है सही स्थिति पर केंद्रित है उठाया. एक 30 गेज सुई का प्रयोग, परत के एक छोटे से टुकड़ा धीरे से उठाया है सही एक्स और वाई निर्देशांक, पर इतना है कि dura मेटर अवगत कराया है. इस छेद काफी बड़े injectors (0.25mm विस्तृत) के एक फिट होना चाहिए. आरेख के लिए चित्रा 1D देखें . इस तरह, छोटे, 0.25mm विस्तृत छेद खोपड़ी में बना रहे हैं, पर एक्स और प्रत्येक इंजेक्शन साइट के लिए इसी वाई निर्देशांक.
- कांच विंदुक एक sharps कंटेनर में खारिज कर दिया है, और अनुकूलित इंजेक्टर सरणी stereotax करने के लिए जुड़ा हुआ है stereotaxic दबाना का उपयोग है.
- आदेश में सही ढंग से इंजेक्टर सरणी के कोण सेट करने के लिए, दो बाहरी injectors किसी दिए गए संदर्भ बिंदु के लिए calibrated किया जा के रूप में इस प्रकार चुना जाता है. बाद injectors के एक संदर्भ बिंदु के साथ मिलान किया जाता है, रिश्तेदार - एक्स और वाई इंजेक्शन साइटों के बीच दूरी इस सुई लगानेवाला के सापेक्ष और एक दूसरे पर विचार करें. stereotax के अक्षों इतना है कि पूरे इंजेक्टर सरणी एक्स और वाई दिशाओं में इन रिश्तेदार दूरी के द्वारा ले जाया जाता है समायोजित कर रहे हैं. यदि दूसरा इंजेक्टर अब संदर्भ बिंदु के साथ गठबंधन नहीं है, धातु प्रवेशनी ढीला है और घुमाया. इस प्रक्रिया iteratively दोहराया है जब तक सुई लगानेवाला सरणी सही ढंग से angled है.
- वायरस के साथ injectors भरने से पहले, injectors सिलिकॉन तेल के साथ भर रहे हैं जब तक सीरिंज 2 μl बिंदु (या अधिक) पर हैं. यह एक बफर जोन प्रदान करता है, ताकि किसी भी हवाई बुलबुले या टिप में clogging आसानी से तेल आगे धक्का हैमिल्टन पंप का उपयोग सिलिकॉन तेल के साथ फिर से भरना करने के लिए पूरे सिस्टम सिरिंजों के पीछे से, जैसा कि पहले वर्णन के बिना हटाया जा सकता है है.
- Parafilm का एक बाँझ टुकड़ा खोपड़ी पर रखा है, और injectors धीरे Parafilm पर कम कर रहे हैं. बहुत अलग गहराई, एक कस्टम milled भाग (एक सीढ़ी के आकार वस्तु जैसे) के साथ समन्वय के लिए लोड हो रहा है की सुविधा सकता है.
- निम्नलिखित भागों को लगता है कि 1 वायरस के μl प्रत्येक साइट पर लोड किया जा (मात्रा में निम्नलिखित नीचे पहुंचा होना चाहिए अगर छोटी मात्रा वांछित हैं) है. आदेश में गारंटी है कि वायरस के एक μl प्रत्येक साइट पर इंजेक्शन है, वायरस के 1.5 μl Parafilm या प्रत्येक सुई लगानेवाला की नोक पर सीढ़ी पर pipetted है.
- हैमिल्टन पंप के फिर से भरना दर μl 1 / मिनट के लिए सेट, वायरस के 1.2 μl प्रत्येक सुई लगानेवाला में refilled है.
- सबसे लंबे समय तक सुई लगानेवाला की नोक bregma पर चुना है, और तब इंजेक्टर सरणी एक्स और कहा कि सुई लगानेवाला के वाई निर्देशांक में स्थानांतरित कर दिया है. यदि clogging है एक मुद्दा है, अगर बहुत गहरी लक्ष्य शामिल हैं कहते हैं: मस्तिष्क में सुई लगानेवाला सुझावों डालने से पहले भी, यह कभी कभी उचित है पंप infusing शुरू करने के लिए, जब तक वायरस सभी इंजेक्टर सुझावों से उभरते देखा जा सकता है है. यह सुई लगानेवाला सुझावों पर किसी भी हवाई बुलबुले को हटा, और यह भी सुनिश्चित करता है कि वहाँ कोई clogging है. Clogging के मामले में, हैमिल्टन पंप 2 μl / मिनट की एक उच्च गति पर एक संक्षिप्त नाड़ी दिखे, धीरे से बाहर स्पष्ट clogging करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
- सुई लगानेवाला सरणी तो छोटे 30 गेज सुई के साथ बनाया छेद के माध्यम से उतारा है, सही Z-गहराई.
- 0.1 μl / मिनट, 1 वायरस के μl प्रत्येक सुई लगानेवाला के माध्यम से इंजेक्शन है.
- इंजेक्शन 30 मिनट के लिए अकेला छोड़ दिया जाता है.
- इंजेक्टर सरणी के बाद धीरे धीरे मस्तिष्क से निकाला जाता है, हैमिल्टन पंप 0.1 μl / मिनट की एक ही दर पर पानी में डालना, क्रम में प्रत्येक सुई लगानेवाला में clogging के लिए जाँच करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
- फिर injectors 2 μl / मिनट में इथेनॉल के 1.5 μl refilling और infusing द्वारा साफ कर रहे हैं.
- अंत में, injectors सिलिकॉन तेल 2 प्रत्येक हैमिल्टन सिरिंज में μl बफर जोन बनाए रखने के साथ refilled हैं.
- सभी उपकरण प्रक्रिया के पहले और बाद में निष्फल होना चाहिए अपने संस्थान जैव सुरक्षा और पशु उपयोग प्रोटोकॉल के अनुसार,.
6. प्रतिनिधि परिणाम
समानांतर इंजेक्टर सरणी एक सर्जरी की गति मोटे तौर पर एक injectors की संख्या के बराबर कारक द्वारा, सेटअप और वसूली समय की गिनती नहीं है, हालांकि अलग - अलग बार व्यवसायी के कौशल पर निर्भर करेगा. एक एक microliter इंजेक्शन के लिए, हम आम तौर पर लगभग व्यास 1mm (छवि 1E) के एक क्षेत्र में lentivirus अभिव्यक्ति देखा. इंजेक्शन के सटीक जैसे कि टिप स्थिति में परिवर्तनशीलता, परीक्षण से परीक्षण करने के लिए, के बारे में 45 microns (इरादा टिप स्थिति के लिए टिप स्थिति से दूरी के मानक विचलन) था.
चित्रा 1. डिजाइन, कार्यान्वयन और एक समानांतर वायरस सुई लगानेवाला सरणी का उपयोग. समानांतर इंजेक्टर सरणी प्रणाली के एक योजनाबद्ध, तीन एक साथ इंजेक्शन के लिए एक ट्रिपल इंजेक्टर विन्यास, दिखा रहा है बी, एक ट्रिपल समानांतर इंजेक्टर सरणी की तस्वीर के रूप में एक में diagrammed .
Discussion
हाल के वर्षों में, अनुवांशिक इनकोडिंग ऑप्टिकल sensitizers का एक संख्या न्यूरॉन्स सक्षम है करने के लिए सक्रिय हो और vivo में खामोश अस्थायी सटीक एक फैशन में प्रकाश का संक्षिप्त दालों के जवाब में (जैसे, 1,4,5,6,7,8 11,). एक प्रमुख विधि के साथ जो न्यूरॉन्स स्तनधारी मस्तिष्क में प्रकाश अवगत किया गया है, जैसे lentiviruses और एडिनो - जुड़े वायरस (AAV) वायरस है, जो opsins के लिए चूहों से बंदरों को लेकर जानवरों के दिमाग के लिए जीन एन्कोडिंग देने कर सकते हैं के माध्यम से एक है, सुरक्षित और स्थायी फैशन (जैसे, 2,9,10). वायरस तेजी से बदलाव समय की तुलना में ट्रांसजेनिक्स की अनुमति जीवों कि चूहों और बंदरों जैसे आनुवंशिक मॉडल जीवों नहीं कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से, और opsins के लिए उच्च अभिव्यक्ति के स्तर कि ट्रांसजेनिक स्थितियों में संभव नहीं हो सकता सक्षम हो सकता है. यहाँ हम एक समानांतर सुई लगानेवाला बनाने में सक्षम एक तेजी से timescale में, सरणी, "सर्किट - स्तर ट्रांसजेनिक्स," पूरे तीन आयामी मस्तिष्क संरचना virally एक जीन के साथ लक्षित सक्षम करने के एक एकल शल्य चरण में प्रदर्शित करता है. सुई लगानेवाला सरणी से एक या एक से अधिक विस्थापन पंपों कि एक उच्च दबाव सहिष्णु संबंधक के माध्यम से प्रत्येक ड्राइव सीरिंज का एक सेट है, जिनमें से प्रत्येक एक इनकार polyimide / सिलिका में फ़ीड केशिका शामिल हैं. capillaries के आकार के हैं, और फिर में, वांछित एक stereotactic पोजीशनिंग बोर्ड कस्टम मिलिंग द्वारा निर्दिष्ट स्थानों डाला, इस प्रकार मस्तिष्क क्षेत्रों के वांछित सेट करने के लिए वायरस या अन्य अभिकर्मकों वितरित करने की अनुमति. डिवाइस का उपयोग करने के लिए, सर्जन पहली बार fluidic उपतंत्र पूरी तरह से तेल के साथ भरता है वायरस से capillaries backfills, मस्तिष्क में डिवाइस आवेषण, और अभिकर्मकों धीरे रहता (<0.1 μL / मिनट).
इस तकनीक millisecond-timescale complexly के आकार का संरचनाओं के बंद (जैसे कि हिप्पोकैम्पस के रूप में) व्यवहार के दौरान सटीक समय पर, द्विपक्षीय संरचनाओं कि redundantly कार्य कर सकते हैं अस्थायी सटीक निष्क्रियता जैसे प्रयोगों के नए प्रकार, की एक विस्तृत विविधता को सक्षम (जैसे बाएँ और दाएँ) प्रमस्तिष्कखंड, और कई असतत मस्तिष्क (जैसे, क्षेत्रों चरण के दो जुड़ा क्षेत्रों ड्राइविंग की गड़बड़ी का अध्ययन करने के लिए कैसे पार क्षेत्र synchrony के प्रत्येक क्षेत्र के भीतर गतिविधि पर निर्भर करता है है, या एक क्षेत्र के लिए जानकारी उत्तेजक के एक सबसेट का मुंह बंद हुए लक्ष्य है आदेश में समझने के लिए कई लक्ष्यों की जो उन आदानों की प्रभाव mediating के लिए महत्वपूर्ण हैं). रहनुमा में उन जैसे बड़े दिमाग के लिए है, जो हम हाल ही में ऑप्टिकल सेल प्रकार विशिष्ट तंत्रिका 3 सक्रियण, behaviorally प्रासंगिक क्षेत्र में गतिविधि perturbing बड़े, जटिल संरचना के वायरल लेबलिंग आवश्यकता हो सकती है का प्रदर्शन किया है. हम ध्यान दें कि समानांतर सरणियों सुई लगानेवाला के लिए लगभग किसी भी पेलोड इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया हो सकता है - दवाओं, neuromodulators, न्यूरोट्रांसमीटर, या यहां तक कि कोशिकाओं - दिमाग में जटिल 3 - डी पैटर्न में एक अस्थायी सटीक तरीके में,. अंत में, एक translational दृष्टिकोण से, यह संभव है कि तेजी से, रोगी अनुकूलित जीन थेरेपी या दवा वितरण उपकरणों तेजी से किया जा सकता है कस्टम डिजाइन और विकृतियों की एक किस्म के लिए नए उपचार के उपयोग के माध्यम से संभावित से, समर्थन करने के लिए व्यक्तिगत मस्तिष्क geometries के मैच के लिए गढ़े ऑप्टिकल नियंत्रण अणुओं.
सुई लगानेवाला arrays के लिए सटीक होना करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, दोनों spatially और volumetrically. में एक्स और वाई दिशाओं, यह बहुत सही रखा बस काफी बड़े injectors, इतना है कि injectors के समानांतर एक दूसरे से आयोजित कर रहे हैं फिट छेद के साथ एक सस्ती मिनी मिल का उपयोग करते हुए छेद ड्रिलिंग के द्वारा पूरा किया है, और एक सटीक स्थान. Z दिशा में, injectors एक stereotaxic तंत्र का उपयोग छंटनी कर रहे हैं, परिशुद्धता के स्तर stereotaxic ही सर्जरी के बराबर की अनुमति. बड़ा सटीक हैमिल्टन पंप की शुद्धता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लगभग शून्य मृत मात्रा कनेक्टर्स, तरल उच्च दबाव क्रोमैटोग्राफी (HPLC) क्षेत्र से अनुकूलित से उठता है. injectors जुड़े सिलिका केशिका टयूबिंग, जो मजबूत और काफी कठोर है कि यह सटीक आकार और दबाव के तहत रिक्ति का कहना है से बना रहे हैं, बड़ा इस्पात cannulas जैसे विकल्पों की दीवार मोटाई के बिना. छोटे संशोधनों आसानी प्रयोगों की एक किस्म के लिए समानांतर इंजेक्टर सरणी के अनुकूल बनाया जा सकता है है. उदाहरण के लिए, अगर वायरस या बेहतर रिक्ति की एक छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, छोटे केशिका टयूबिंग के साथ एक इसी छोटे ड्रिल बिट, नियोजित कर सकते हैं. भविष्य उपकरणों microfluidic चैनलों और पंपों का उपयोग समानांतर injectors की संख्या में वृद्धि करने के लिए, आकार को कम करने के लिए (शायद इस तरह के उपकरणों आज़ादी से चलती पशुओं के सिर पर घुड़सवार के लिए सक्षम करने) हो सकता है.
Disclosures
सभी प्रक्रियाओं के अनुसार प्रयोगशाला पशु के लिए एनआईएच गाइड के साथ थे और एमआईटी पशु देखभाल और उपयोग और जैवसुरक्षा समितियों द्वारा अनुमोदित है.
Acknowledgments
ESB NIH निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार (DP2 OD002002 01), एनआईएच चैलेंज ग्रांट 1RC1MH088182 01, NIH ग्रैंड अवसर 1RC2DE020919 01-अनुदान, एनआईएच 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 और 0,848,804), McGovern संस्थान Neurotechnology पुरस्कार कार्यक्रम द्वारा धन मानता , रक्षा, NARSAD, अल्फ्रेड पी. स्लोअन फाउंडेशन, जैरी और मार्ज बर्नेट, तंत्रिका विज्ञान, एमआईटी मीडिया लैब, Benesse फाउंडेशन, और वैलेस एच. कल्टर फाउंडेशन में SFN के लिए अभिनव अनुसंधान पुरस्कार विभाग.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Tool | Tool | Dremel | 3956-02 | |
| Laser Cutter | Tool | Universal Laser Systems | VLS2.30 | |
| Hot glue gun | Tool | Stanley Bostitch | GR20 | |
| Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump) | Tool | Harvard Apparatus | 702001 | |
| 10 μl Hamilton syringes | Tool | Hamilton Co | 701N | Need one per injection site |
| Mouse stereotax | Tool | Stoelting Co. | 51725D | |
| Modela mini-mill | Tool | Roland | MDX-15 | |
| 0.011" diameter drill bit for mini mill | Tool | McMaster-Carr | 8915A12 | |
| 1/32" diameter drill bit For mini-mill | Tool | McMaster-Carr | 8848A35 | |
| High speed dental drill | Tool | Lynx | 333 | |
| Dental drill accessories | Tool | Pearson Assessments | F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38 | |
| 1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula | Material | Small Parts, Inc. | HTX-15R | |
| 1-72 binding slotted machine screw | Material | Small Parts, Inc. | MX-0172B | |
| 1-72 hex nut | Material | Small Parts, Inc. | HNX-0172 | |
| PCB proto-board, 1/32" thick | Material | Digi-Key | PC57-T-ND | |
| Acrylic Sheet, 1/8" thick | Material | McMaster-Carr | 8560K239 | |
| HPLC connectors | Material | Upchurch Scientific | F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number) | Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused |
| Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm | Material | Polymicro Technologies | 2000022-10M | |
| 5-minute general purpose epoxy | Material | Permatex | 84101 | 5-minute general purpose epoxy |
| Polyethylene tubing .066 x .095 inch | Material | VWR international | 63018-827 |
References
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