Immunology and Infection

Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

Published: July 10, 2010 doi: 10.3791/1546

Sreemanti Basu¹, Hope M. Campbell¹, Bonnie N. Dittel¹, Avijit Ray¹

¹Blood Research Institute, BloodCenter of Wisconsin

Summary

Voor veel wetenschappelijke studies die een biologische en chemische analyse van celpopulaties de cellen moeten worden in een hoge staat van zuiverheid. Fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) is een superieure methode om zuivere celpopulaties te verkrijgen.

Abstract

Experimentele en klinische studies vereisen vaak sterk gezuiverde celpopulaties. FACS is een techniek bij uitstek om celpopulaties van bekende fenotype te zuiveren. Andere bulk methoden van zuivering zijn panning, complement uitputting en magnetische kraal scheiding. Echter, FACS heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere beschikbare methoden. FACS is de beste methode bij zeer hoge zuiverheid van de gewenste bevolking nodig is, wanneer de doelcel bevolking een zeer laag niveau van de identificerende marker drukt of als de cel populaties moeten worden afgezonderd op basis van differentiële marker dichtheid. Daarnaast, FACS is de enige beschikbare techniek voor de zuivering cellen op basis van interne vlekken of intracellulaire eiwit expressie, zoals het een genetisch gemodificeerd fluorescerend eiwit marker te isoleren. FACS maakt de zuivering van de individuele cellen op basis van grootte, korreligheid en fluorescentie. Om de cellen van belang te zuiveren, worden ze eerst gekleurd met fluorescent-gemerkte monoklonale antilichamen (mAb), die specifieke oppervlakte markers op de gewenste cel bevolking (1) te erkennen. Negatieve selectie van ongekleurde cellen is ook mogelijk. FACS zuivering vereist een flowcytometer met het sorteren van de capaciteit en de juiste software. Voor FACS, worden de cellen in suspensie doorgegeven als een stroom in druppeltjes met elk een afzonderlijke cel in de voorkant van een laser. De fluorescentie detectie systeem detecteert de cellen van belang op basis van vooraf bepaalde fluorescerende parameters van de cellen. Het instrument is van toepassing ten laste van de druppel met een cel van belang en een elektrostatische afbuiging systeem faciliteert collectie van de geladen druppeltjes in de juiste verzameling buizen (2). Het succes van kleuring en daarmee sorteren hangt grotendeels af van de keuze van de identificerende markers en de keuze van mAb. Sorteren parameters kunnen worden aangepast afhankelijk van de eis van zuiverheid en opbrengst. Hoewel de FACS vereist gespecialiseerde apparatuur en opleiding van personeel, het is de methode van keuze voor isolatie van sterk gezuiverde celpopulaties.

Protocol

Voordat u begint met het proces, de volgende items dienen te worden om verzameld en voorbereid:
1. Ijs
2. 15 ml conische buizen voor kleuring cellen en 12 x 75 mm stroom buizen voor het beitsen van enkele kleur controles.
3. Vlekken buffer: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) + 3% foetaal kalf serum (FCS)
4. Pipetten
5. Fc blok (indien nodig) en vlekken antilichamen. Antilichamen moeten worden getitreerd voor een optimale kleuring.
6. Compensatie kralen
7. Vering buffer: Balanced Salt Hank's Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
8. Trypan blauw en hemocytometer
9. Cel zeef (40 um Nylon)
10. Collectie buizen: twee soorten collectie buizen kunnen worden gebruikt a) 12 x 75 mm polystyreen buizen (die 300 ul FCS en 25 mM HEPES) of b) 15 ml conische buizen (met 1 ml FCS + 25 mM HEPES). Elke rijk medium met een hoge serum-concentratie kan worden gebruikt voor het verzamelen van de gesorteerde cellen.
Het genereren van een enkele cel opschorting van de start celpopulatie.
Optioneel: Verrijk voor de gewenste celpopulatie met een bulk-zuivering methode zoals aanvulling op uitputting of magnetisch sorteren. Het belangrijkste voordeel van de verrijking stap is dat het het soort tijd vermindert.
Een keer wassen cellen met vlekken buffer.
Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vlekken buffer bij een concentratie van maximaal 50 x 10 ⁶ voor een efficiënte kleuring.
Optioneel: Voor cellen die een hoge mate van FcR, blokkeren de receptoren te blokkeren met behulp van een geschikte methode. Een methode van keuze is het gebruik van een mAb dat zich bindt aan op ijs FcγR gedurende 10-15 minuten. Deze antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar.
Voeg de juiste mAb (bij een vooraf bepaalde concentratie) om de gewenste celpopulatie vlek en voor 20-30 min op ijs in het donker, gevolgd door twee wassen met vlekken buffer incuberen. Optioneel: Kleuren met een vitale kleurstof, zoals propidiumjodide, kunnen worden opgenomen om de dode cellen (5) te onderscheiden. Als multi-color kleuring is om te worden gebruikt, zijn enkele kleur controles daarop. We maken gebruik van BD CompBeads om een kleur controles voor te bereiden met behulp van protocol van de fabrikant.
Als u geen direct geconjugeerde antilichamen, herhaal dan stap 7 met behulp van de passende secundaire antilichaam of streptavidine conjugaat.
Na het wassen, resuspendeer de cellen in kweekmedium en bepaal de cel concentratie met behulp van een vitale kleurstof, zoals trypan blauw.
Pas de cel concentratie tot 15-20 x 10 ⁶ / ml. Voor de celpopulaties die vorm clusters, die het instrument kunnen verstoppen tijdens het sorteren, de cellen filter door een zeef.
Het opzetten en optimaliseren van de cel sorter. Het proces van het opzetten van een flowcytometer is gevarieerd, afhankelijk van de productie en moet worden uitgevoerd door adequaat opgeleid personeel.
De algemene aanbevelingen zijn als volgt:
1. Selecteer de juiste mondstuk, afhankelijk van het celtype te worden gesorteerd.
2. Voor steriele soorten, steriliseren het instrument.
3. Voer instrument voor kwaliteitscontrole met kralen om te controleren of lasers zijn functioneren, en het is nauwkeurig sorteren.
4. Installeer de vereiste collectie apparaat en het opzetten van de kant stromen.
5. Kijk naar laser van het instrument en de detector opgezet om de fluorescente labels die kunnen worden gebruikt (onze BD FACS Aria heeft drie lasers en kan detecteren tot negen kleuren) te bepalen.
6. Als het eenmaal is bepaald wat fluorescerende labels zullen worden gebruikt op de celsorteerder, kan schadevergoeding worden uitgevoerd (zoals hieronder uitgelegd).
Voer vergoeding gebruik van de negatieve controle monster en de single positieve controles. Compensatie is nodig om het spectrum overlap tussen de twee detectoren te verwijderen. Is het relevant op te merken dat de compensatie niet dwaas bewijs en wordt negatief beïnvloed door hoe fel bepaalde markers vlek, en door de fluorescentie van cellen die een lage autofluorescentie wat kan leiden tot een slechte resolutie tussen dim en de negatieve populaties hebben.
Voor de beste resultaten moet de experimentele opzet omvatten het gebruik van heldere fluorochromen met markers die lage expressie hebben of die niet beschikken over een bekend kleuringspatroon. Markers die een goede scheiding tussen celpopulaties en zijn hoog tot expressie te bieden moet worden gebruikt met een dimeer fluorochromen zoals die opgewonden door rood of violet lasers.
1. Compensatie kan worden uitgevoerd met compensatie kralen, die zijn polystyreen microdeeltjes die zijn gekoppeld aan een antilichaam dat specifiek is voor de Kappa lichte keten van Ig van muis, rat, of ratten / hamster. De parels zijn gemakkelijk te vlek, hebben een robuust signaal en bieden een eenvoudige manier te bereiden enkele gekleurde controles die de dezelfde fluorofoor als de experimentele monsters.
2. Stel een sjabloon dat een bivariaat complot om voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC), en een histogram weer te geven voor onderelke fluorochroom die zullen worden gebruikt.
3. Voer de negatieve controle buis en pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) aan de bevolking van de rente op schaal plaats.
4. Pas de fluorescentie PMT instellingen om de negatieve bevolking of autofluorescentie in het uiterste linker gedeelte van het histogram plaats.
5. Noteer de negatieve controle buis.
6. Voer de single positieve controle buizen en noteer de data voor elke buis.
7. Teken een interval hek rondom het positieve deel van de gegevens op het histogram, en een ander interval hek aan de negatieve gedeelte van het histogram.
8. Handmatige compensatie wordt gedaan door het aanpassen van de mediaan (mediaan is een betere schatting van de centrale tendens is dan het gemiddelde op een logaritmische schaal) van de positieve totdat het gelijk is aan de mediaan van de negatieven. Dit moet gebeuren voor elk van de fluorochroom labels gebruikt in het experiment.
9. Om de mediaan, passen de spectrale overlap waarden hoger of lager totdat de medianen voor elke TL-parameter zo dicht mogelijk te maken.
10. Compensatie kan ook automatisch worden gedaan met analyse software. Automatische compensatie maakt gebruik van de geregistreerde gegevens van de schadevergoeding regelt voor de berekening van een algebraïsche matrix voor alle fluoroforen gebruikt in het experiment. Deze waarden worden gebruikt om af te trekken uit de bijdragen van de niet-primaire kleuren die worden bloeden in detector een primaire kleur is.
Noteer de experimentele monster worden gesorteerd en gebruik gating tools en subsetting methoden om de populaties van belang te definiëren.
1. Stel de experimentele sjabloon met een dot plot dat FSC vs SSC displays en gebruik maken van een gating tool, veelhoek, rechthoek, interval of het kwadrant aan de poort van de bevolking van belang. De scatterplot geeft de fysische eigenschappen van de cel dat verschilt naar de cel type.
2. De beste manier om de fluorescentie gating strategie te bepalen is het gebruik van fluorescentie minus een (FMO) controles. In een FMO-controle buis alle reagentia die worden gebruikt in het experiment zijn opgenomen, behalve voor de een van belang. De FMO helpt onderscheid te maken tussen zwak-lood bevolking en brede negatieve populaties.
3. Gebruik maken van de gegevens opgenomen van FMO buizen om te bepalen waar hekken plaats binnen de experimentele buis.
Zodra poorten zijn bepaald, kan de poorten worden geselecteerd voor het sorteren in de externe collectie buizen. Tot vier poorten (of populaties) kunnen worden gesorteerd in een keer, afhankelijk van de instrumentatie ter beschikking.
Voer de experimentele monsterbuis bij 4 ° C, zet doorbuiging platen, en sorteren van het monster. 5 x 10 ⁵ -1,5 x 10 ⁶ cellen kunnen worden gesorteerd in een 12 x 75 mm buis en 1,5 x 10 ⁶ - 4,5 x 10 ⁶ cellen kunnen worden gesorteerd in een 15 ml conische.
Zodra het vereiste aantal cellen is verkregen, handmatig stoppen sorteren.
Voer een post-soort analyse om de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties bepalen.

Representatieve resultaten

We hebben hier aangetoond dat de uitkomsten voor muis milt B en CD4 T-cel sortering (figuur 1). Splenocyten werden gekleurd met PE Texas Red-geconjugeerd anti-muis-B220, FITC-geconjugeerd anti-muis-TCRβ en Alexafluor-700-geconjugeerd anti-muis-CD4 om B-cellen (B220 + TCRβ-) en CD4 T-cellen (CD4 + + TCRβ te identificeren ). Het sorteren werd uitgevoerd met BD FACS Aria instrument. Na het sorteren van de B-cel zuiverheid was> 97% en de CD4 T-cel zuiverheid was> 98%.

Figuur 1. Zuiverheid van de milt B-cellen en CD4 T-cellen na FACS. Mouse splenocyten werden gekleurd met anti-muis B220, TCRβ en CD4 antilichamen. FACS voor de B-cellen werd uitgevoerd met behulp van een BD FACS Aria door gating op B220 + TCRβ-cellen (Fig. 1A, linker paneel, rechtsonder kwadrant). Een post sorteren analyse werd uitgevoerd om de zuiverheid van de B-cellen (Fig. 1A, rechter paneel) te bepalen. B220 kleuring is weergegeven op de x-as en TCRβ vlekken op de y-as. FACS voor de CD4 T-cellen werd uitgevoerd met behulp van dezelfde flowcytometer door gating op TCRβ + CD4 + cellen (Fig. 1B, linker paneel, rechtsboven kwadrant). Een post sorteren analyse werd uitgevoerd om de zuiverheid van de CD4 T-cellen (Fig. 1B, rechter paneel) te bepalen. TCRβ kleuring is weergegeven op de x-as en CD4 vlekken op de y-as. Het percentage positieve cellen in elk kwadrant wordt weergegeven.