Summary
אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.
Abstract
אנקפסולציה 3D של תאים בתוך הידרוג מהווה טכניקה חשובה יותר ויותר פופולרי עבור תאים culturing וכלפי בפיתוח בונה עבור הנדסת רקמות. סביבה זו טובה יותר מה מחקה תאים להתבונן in vivo, לעומת בתרבית רקמה רגילה, בשל רקמה דמוית מאפייני סביבת 3D. הידרוג פולימריות סינתטיים הם מים נפוחות רשתות יכול להיות מתוכנן להיות יציב או להשפיל באמצעות הידרוליזה או proteolysis כמו רקמה חדשה מופקד על ידי תאים כמוס. מגוון רחב של פולימרים נחקרו עבור יישומים אלה, כגון פולי (אתילן גליקול) וחומצה היאלורונית. ברוב המקרים הפולימר הוא פונקציונליות עם קבוצות תגובתי כגון methacrylates או acrylates מסוגל crosslinking עוברת דרך מנגנונים שונים. בעשור האחרון, התקדמות רבה נעשתה הנדסה microenvironments אלה - למשל, באמצעות שילוב קוולנטיים פיזית או תליון של סימנים ביוכימיים - כדי לשפר את הכדאיות ישיר פנוטיפ הסלולר, כולל התמיינות בתאי גזע במארז (Burdick et al.).
השיטות הבאות אנקפסולציה 3D של תאים מוטבו במעבדות אחרות שלנו, על מנת למקסם את cytocompatibility ולצמצם את מספר הצעדים עיבוד הידרוג'ל. ב הפרוטוקולים הבאים (ראה תרשים 1 להמחשה של ההליך), ההנחה היא כי פולימרים פונקציונליות מסוגל לעבור crosslinking כבר ביד, ביקורות מצוינות של כימיה פולימר ליישם לתחום הנדסת הרקמות ניתן למצוא במקום אחר (Burdick et al.) וכן בשיטות אלה עולים בקנה אחד עם מגוון רחב של סוגי פולימר. יתר על כן, בנוסף מייקל מסוג (ראה Lutolf et al.) ואור יזומה חינם הרדיקלי (ראה Elisseeff et al.) מנגנוני התמקדו כאן מהוות רק חלק קטן של טכניקות crosslinking דיווח. Crosslinking מצב מעורבת, שבה חלק קבוצות תגובתי נצרכת לראשונה על ידי crosslinking בנוסף ואחריו מנגנון רדיקלי, הוא עוד הפרדיגמה הנפוצה והחזקה על בימוי הפנוטיפ של תאים במארז (Khetan et al. סלינס et al.).
Protocol
א הכנת חומר עיקור
- לפני הכנת חומרי אנקפסולציה, להכין פתרון 0.5 wt% מכלל photoinitiator Irgacure 2959 (I2959) ב פוספט בופר סליין (PBS), על ידי ערבוב דוגרים במשך כמה ימים על 37 ° C. הפתרון אז יכול להיות מזרק מסונן עבור העיקור לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש לטווח ארוך.
- בהתבסס על ההרכב הרצוי של ג'לים להיות מסונתז, לחשב (באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני כגון Microsoft Excel) את המשקל של פולימר crosslinker הצורך. בגלל משקל נתון של פולימר חייב להיות מומס בהיקף כולל מוגדר להשגת הריכוז הרצוי הידרוג, crosslinker וחלקים פולימר פתרון נפח ג'ל הכולל חייב להיות גם נקבע באמצעות גיליון אלקטרוני. חישובים דומים צריך להיעשות, אם בכלל moieties תליון (למשל, RGD דבק או YGSR המכיל oligopeptide) הם להיות משולב לפני crosslinking.
- לשקול את הכמות הנדרשת של פולימר crosslinker ומקום לתוך צינורות Eppendorf. התאם את גיליון החישוב בהתאם למשקל בפועל של פולימר המתקבל. (הערה: את הכרכים ניתן לשנות כדי לפצות על המסה בפועל של פולימר crosslinker שהושגו).
- הכן תבניות ג'ל באמצעות סכין גילוח לחתוך את ראשיהם של עטוף בנפרד 1 מ"ל סטרילי מזרקים חד פעמיים. ודא לחתוך שטוח הוא עשה עבור תבניות לשמש ג'לים photopatterned.
- מניחים את תבניות מזרק, צינורות Eppendorf (עם כובעי פתוח) וכל החומרים הדרושים אחרים תחת מקור אור קוטל חידקים (בדרך כלל בנויה לתוך ארונות בטיחות ביולוגית) ו לחטא במשך 30 דקות.
ב ההכנה Cell
- לאחר העיקור, להוסיף נפח מתאים חיץ סטרילי (לפי חישובים אלקטרוני, בעוד הבחירה של חיץ יכול להשתנות, PBS ו חיץ בסיס חלש כמו triethanolamine משמשים בדרך כלל עבור crosslinking הקיצוני מיכאל מסוג חינם, בהתאמה) על Eppendorf פולימר (אופציונלי) תליון מחצית להיכלל (למשל, הפפטיד דבק) ו מערבולת לפזר (אם vortexing מחוץ לעטוף את מכסה המנוע סטרילי Eppendorf עם parafilm).
- הוספת נפח מתאים של הפתרון מחצית תליון לפתרון פולימר לעטוף את החותם עם parafilm. בקצרה מערבולת לדגור על 37 מעלות צלזיוס להגיב (במידת האפשר, על גבי צלחת ומערבבים סיבובית) במהלך הכנת התא. זה כולל את תגובת תיאול על פפטיד (דרך קבוצת ציסטאין) כדי Acrylate או methacrylate כך פפטיד נכלל כקבוצה תליון ב הידרוג הסופי.
- Trypsinize לספור תאים נפרדים לחלקים המכילים את המספר המתאים עבור כל קבוצה של ג'לים. לדוגמה, עבור קבוצה של שלושה 50 ג'לים μL בצפיפות של 10 מיליון תאים / מ"ל, נפרד 1,500,000 תאים לתוך צינור חרוטי בודדים. מומלץ לא יותר מ 4 ג'לים להיות מוכן להגדיר אדם בשל עיתוי gelation (הערה: אם סינתזה קבוצות מרובות של ג'לים, Eppendorf יחיד המכיל נפח נאותה פתרון פולימר עבור קבוצות כל יכול להיות מוכן).
- צנטריפוגה התאים.
- בעוד התאים ספינינג למטה
- אור יזם crosslinking רדיקלים חופשיים: להוסיף 0.5 פתרון wt I2959% לפתרון פולימר שווה ל 10% של נפח ג'ל הכולל סט (עבור ריכוז יוזם הסופי של 0.05% wt).
- מייקל מסוג (בנוסף) crosslinking: להוסיף חיץ crosslinker כדי להשיג את הפתרון המתאים הריכוז.
- עבור crosslinking רציפים: ג'לים אלה לשלב את שני סוגי crosslinking ומחייבים את שני השלבים הקודמים.
ג גיבוש Hydrogel
- לשאוב supernatant חלק מן התא centrifuged. חכו נוזלי להתיישב לאחר השאיפה הראשונית מחדש לשאוב להסיר התקשורת ככל האפשר מבלי לשבש את התא גלולה.
- Resuspend התא גלולה עם פתרון פולימר עד התאים מחולקים באופן שווה. מזעור היווצרות בועות על ידי לאט pipetting הפתרון מעלה מטה (בערך 10 מחזורים צריך להספיק כדי להפיץ תאים).
- Crosslinking הידרוג
- אור יזם crosslinking רדיקלים חופשיים: Aliquot נפח מתאים לתוך תבניות קצה המזרק. לחשוף את המזרקים לאור UV עבור crosslinking קיצוני (למשל, 10 דקות חשיפה ל 365 ננומטר, 4 mW/cm2 אור UV נפוץ פולימרים Acrylate פונקציונליות). צעד זה צריך להתבצע במהירות כדי למזער תא שיקוע לפני החשיפה לאור UV.
- מייקל מסוג (בנוסף) crosslinking: שימוש קצה פתח רחב פיפטה, להוסיף נפח מתאים של תמיסת crosslinker לפתרון פולימר / תא, הגדר את הפיפטה לנפח הרצוי הג'ל בודדים, פיפטה הפתרון מעלה ומטה כדיhomogenize ו aliquot לתוך תבניות קצה המזרק. צעד זה צריך להתבצע במהירות, כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים. אפשר 10-30 דקות (תלוי במערכת בודדים) הדגירה בשכונה תרבות crosslinking.
- Crosslinking סדרתית: זה כולל את התגובה מייקל מסוג בנוסף הראשון ולאחר מכן חשיפה לאור עבור crosslinking השני. רק חלק קטן של crosslinks תיאורטית אמור להיות הגיבו במהלך crosslinking הראשון ולאחר מכן מסיכה סטרילית יש להחיל ישירות על פני ג'ל לפני חשיפה לאור באמצעות פינצטה מעוקרים. לצבוע פונקציונליות (rhodamine למשל, methacrylated (MeRho) בריכוז הסופי ג'ל של 20 ננומטר) ניתן גם להוסיף את הפתרון הראשוני לדמיין את דפוסים, שכן ישלבו מעדיפים באזורים crosslinked קיצוני של ג'ל (איור 2 ).
ד תרבית תאים וניתוח
- בעקבות crosslinking, ג'לים לצלול לתוך בארות צלחת רקמה המכילה תרבות מדיה הדגירה וניתוח (ראה השלבים הבאים).
- תאים יכולים להיות דמיינו עבור מורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 3: בדרך כלל, הידרוג מסונתז שקופים) ו הכדאיות באמצעות ערכת פלורסנט חי / מת מכתים (איורים 3, 4). מכתים עבור הסלולר אקטין (למשל, rhodamine או והעמסת שכותרתו phalloidin) גרעינים (למשל, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) ניתן לבצע באמצעות קיבוע תקן ונהלים permeabilization (איור 4) עם בהליך הבא.
- לשטוף בונה 3X עבור 5 דקות עם PBS.
- תקן ג'לים על ידי הדגירה בפורמלין מ"ל 1 4% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף בונה 3X עם פתרון חסימת המכיל 3% (w / v) BSA ו -0.5% (w / v) Tween ב PBS.
- Permeabilize קרום עם 0.25% (w / v) טריטון X בחסימת פתרון עבור 20 דקות.
- לשטוף בונה 3X עם חסימת פתרון.
- כתמים על אקטין-F עם 0.66 מיקרוגרם / מ"ל FITC או rhodamine phalloidin בחסימת פתרון במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3x עם חסימת פתרון.
- הכתם גרעינים באמצעות הסלולר 0.4 μL / mL DAPI ב PBS עבור 20 דקות.
- לשטוף 3X עם PBS.
- דמיינו התאים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent או confocal.
- התרבות התאים בתוך ג'ל נבחנת בדרך כלל באמצעות מבחני זמינים מסחרית (DNA למשל, מסך או תוכן ביוכימיים). PicoGreen הוא חומצה נפוץ ורגיש גרעין הניאון כתם לכימות פעמיים גדילי דנ"א (Singer et al.). תאים יכול להיות גם ספר ו מנורמל למספר פקד ראשוני בשיטות הדמיה המתואר בשלב 2.
- חתך מכתים היסטולוגית והוא יכול גם לשמש כדי לחזות תאים נוצרו מטריקס. הפרוטוקול הבא עבור התייבשות ועל חתך של הידרוג 3D ניתן להשתמש כדי להשיג חתך פרוסות בשקופיות זכוכית:
- קיבוע והתייבשות
- לשטוף הדגימה 3X ב PBS.
- תקן של 5 - 30 דקות ב paraformaldehyde 4%.
- לשטוף הדגימה 3X ב PBS.
- דגירה לדוגמה EtOH של 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בכל אחד EtOH הבאים (v / v) ריכוזים במים (לפי הסדר): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (בשלב זה, דגימות ניתן לאחסן לילה של 25 ° C).
- ניקוי ו הסתננות
- העברה של 100% עבור שעות Citrisolv 1 במהירות של 25 ° C, ואחריה שעה אחת ב 65 ° C.
- גזור דגימות במחצית בסכין גילוח בצלחת פטרי כזה חתך של המדגם הוא חשוף.
- העברה תערובת 01:01 של Citrisolv / Micro-לחתוך פרפין עבור שעה 1 ב 65 ° C.
- העברה פרפין מיקרו לקצץ 100% עבור שעות 1 ב 65 ° C.
- העברה פרפין מיקרו לקצץ 100% לילה בשעה 65 ° C.
- העברה פרפין מיקרו לקצץ 100% 1-2 שעות 65 ° C.
- הטבעת
- מיקום הדגימה בדפוס לקלף, עם פרפין 100%.
- מניחים כמות קטנה של שעווה במיטה עובש, להכניס את שני החצאים של המדגם עם החתך כלפי מטה.
- החל חתיכת מסנן למעלה
- הוסף שעווה נוספים להטביע את פיסת העליון לאפשר להתקשות במשך ~ 10 דקות.
- העברת מוסיף על 4 ° C מקרר לאפשר הדגימה להקשיח לילה.
- הדגימה עשויה להיות סעיףעורך למחרת, בדרך כלל בעובי 5-10 מיקרומטר לכל פרוסה באמצעות microtomes זמינים מסחרית. בדרך כלל עובש את הקליפה, משם הוא רכוב אנכית כנגד הבמה microtome, בקרות ידנית משמשים כדי לקבוע את עובי סעיף, מבצעה ויישור של המדגם עם הלהב.
- הפקת רנ"א
התבטאות גנים יכול להיות גם הערכה כמותית (למשל, באמצעות תגובה בזמן אמת שרשרת פולימרז (PCR)). פרוטוקול להפקת RNA מן הידרוג 3D, דוגמה אשר ניתנת בהמשך, שונה לגמרי במקרה 2D הרבה יותר פשוט.- לייבל RNAse מוסמך צינור חינם Eppendorf עבור כל הידרוג 3D ולהוסיף 500 Trizol מגיב μL ® כדי צינור אחד.
- השתמש העלי (מטחנת רקמות) באופן ידני טוחנים את הידרוג עד פתרון ברור מתקבל. ומטחנות ודא שונים משמשים עבור כל תנאי.
- וורטקס Eppendorf עבור כל 20 שניות homogenize דגימות.
- דגירה דגימות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי לאפשר ניתוק מוחלט של מתחמי nucleoprotein.
- דגימות קול על הקרח עבור 20 דקות
- הוספת 200 μL (לכל Trizol מ"ל) כלורופורם לטעום כל מערבולת.
- דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך דקות חמש.
- צנטריפוגה דגימות XG 12,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- מעבירים את השלב מימית (השכבה העליונה ברור) חדשים Eppendorf צינורות (הימנעות אזור interfacial והתחתון אדום, פנול, כלורופורם שלב). RNA נותר בשלב מימית ברור.
- טכניקות נפוצות עבור בידוד RNA ואחסון כעת ניתן להשתמש.
- לאחר מיצוי RNA, ערכות זמינים מסחרית עבור transcriptase הפוכה בזמן אמת PCR משמשים לעתים קרובות עם כמה שינויים (Elisseff et al. Strehin et al.).
- קיבוע והתייבשות
נציג תוצאות:
ראה תרשימים 2-4 (הפניה כמו הפרוטוקולים לעיל) עבור תוצאות נציג להדמיה של הידרוג photopatterned ו אנקפסולציה של תאים בתוך ג'ל.
באיור 1. סקירה כללית של ההליך אנקפסולציה 3D. צעדים תרשים מתאימות כותרות הסעיפים הפרוטוקולים בשלבים.
2. איור Photopatterned הידרוג באמצעות פילמור רציפים מייקל מסוג בנוסף הקיצוני אז. (א) סכמטי של photopatterning של הידרוג crosslinked חלקית עם שילוב של צבע תגובתי צילום. (ב) מעגל או (ג) הסרט פס מסכת שקיפות בדוגמת הידרוג חומצה היאלורונית. Rhodamine Methacrylated (MeRho) נכלל רק באזורים של הג'ל שנחשפו לאור. ברים סולם = 100 מיקרומטר.
איור 3. ויזואליזציה של תאים הידרוג 3D. בתאי גזע דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה (א) אור או (ב) חי (ירוק, Calcein PM) ומתים (אדום, Ethidium homodimer-1) מכתים 24 שעות לאחר אנקפסולציה של 1 מיליון תאים / מ"ל ב הידרוג חומצה היאלורונית crosslinked באמצעות אור יזם מנגנון של רדיקלים חופשיים. ברים סולם = 100 מיקרומטר.
איור 4. ויזואליזציה של תאים הידרוג 3D. hMSCs מוכתם עבור (א) בתאים חיים (Calcein PM) או (ב) הסלולרי אקטין (rhodamine phalloidin) גרעינים (DAPI) חמישה ימים לאחר אנקפסולציה של 1 מיליון תאים / מ"ל ב הידרוג חומצה היאלורונית crosslinked באמצעות מנגנון מסוג מיכאל ( באמצעות דבק תליון פפטידים bifunctional crosslinkers פפטיד מתכלה proteolytically). ברים סולם = 100 מיקרומטר.
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים מייצגים שיטה פשוטה ורבת עוצמה כדי לתמצת תאים בתוך פיגומים הידרוג באופן cytocompatible. טכניקות כאלה חשובים במיוחד מאז הבדיל סופני ותאי גזע יכולים להפגין התנהגות שונה במידה ניכרת לעומת microenvironments 2D-3D. גם עבור גישות טיפוליות הכרוכות ההשתלה של חומרים (למשל, באתרו פילמור רדיקלי), אנקפסולציה התא ניתוח הכדאיות והבחנה יכול לעזור בתהליך הפיתוח החומר. תהליך רציף המתואר יכול לשמש מרחבית לתפעל את הסביבה הידרוג'ל, והתנהגות הסלולר וכתוצאה מכך (ראה Khetan et al.).
בסך הכל, האלמנט הקריטי ביותר של פרוטוקולי תיאר הוא ההומוגניות של כל פתרונות בשימוש. בפרט, טיפול מיוחד יש לנקוט כדי להבטיח את התאים מחולקים באופן שווה בפתרון prepolymer, וכי הפתרון הוא מעורב היטב על ידי resuspension פיפטה בעקבות התוספת של הפתרון crosslinker. הימנעות להבטיח זה יכול להוביל clumping של תאים או וריאציות מקומיות במבנה ג'ל ונפיחות.
בעוד הפרוטוקולים שהוצגו כאן מתמקדים בעיקר ההליך עבור תאים encapsulating, חשוב לציין גם כי אנקפסולציה עשוי להצריך מעט הסתגלות פרוטוקולים ניתוח נכתבים בדרך כלל עבור זריעת 2D. דוגמאות אחדות באו לידי ביטוי המאפשר הדמיה להערכת התאים הידרוג.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי עמיתי הקרן הלאומית למדע ומחקר בוגר כדי SK ו - National Institutes of הית מענק R01EB008722.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| .2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
| Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
| Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
| DAPI | Reagent | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591 | |
| Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Citrisolv | Reagent | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
| Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| 0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 mL disposable syringes | Equipment | BD Biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
| Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma-Aldrich | P6800 | |
| Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| 254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
- Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A.
- Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C.
- Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells. Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).
- Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
- Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels. Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).
