Cellular Inkapsling i 3D Hydrogeler för tissue engineering

Summary

Vi presenterar protokoll för 3-dimensionell (3D) inkapsling av celler i syntetisk hydrogel. För inkapsling Förfarandet beskrivs två vanliga metoder för crosslinking (Michael-typ utöver och lätta initieras fria radikaler mekanismer), samt ett antal tekniker för bedömning inkapslade cellens beteende.

Abstract

3D-inkapsling av celler i hydrogeler utgör en allt viktigare och populär teknik för att odla celler och för att utveckla konstruktioner för tissue engineering. Denna miljö härmar bättre vad cellerna observera in vivo, jämfört med vanliga vävnadskultur, på grund av vävnad-liknande egenskaper och 3D-miljö. Syntetiska polymera hydrogeler är vatten-svullna nätverk som kan utformas för att vara stabil eller att förnedra genom hydrolys eller proteolys som ny vävnad deponerats av inkapslade celler. En mängd olika polymerer har undersökts för dessa applikationer, såsom poly (etylenglykol) och hyaluronsyra. Vanligast är den polymer functionalized med reaktiva grupper som metakrylater eller akrylater kan genomgå crosslinking genom olika mekanismer. Under det senaste decenniet har stora framsteg gjorts inom teknik dessa mikromiljöer - t ex via de fysiska eller hängande kovalenta införlivandet av biokemiska signaler - för att förbättra lönsamheten och direkt cellulära fenotyp, inklusive differentiering av inkapslade stamceller (Burdick et al.).

Följande metoder för 3D inkapsling av celler har optimerats i våra och andra laboratorier för att maximera cytocompatibility och minimera antalet steg hydrogel bearbetning. I följande protokoll (se figur 1 för en illustration av förfarandet) är det antas att functionalized polymerer kan genomgå crosslinking redan i handen, utmärkta recensioner av polymer kemi som tillämpas inom tissue engineering kan hittas någon annanstans (Burdick et al.) och dessa metoder är kompatibla med ett utbud av polymer typer. Vidare Michael-typ förutom (se Lutolf et al.) Och lätta initieras fria radikaler (se Elisseeff et al.) Mekanismer som fokuserade på här utgör endast en liten del av de rapporterade crosslinking tekniker. Blandat läge crosslinking, där en del av reaktiva grupper är först förbrukas genom tillsats crosslinking och följdes av en radikal mekanism, är en annan vanligt förekommande och kraftfullt paradigm för att styra fenotypen av inkapslade celler (Khetan et al. Salinas et al.).

Protocol

A. Material Förberedelser och sterilisering

1. Innan förbereda inkapsling material, förbereda en 0,5 wt% lösning av den fotoinitiator Irgacure 2959 (I2959) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), genom att blanda och inkubation under flera dagar vid 37 ° C. Lösningen kan sedan spruta filtreras för sterilisering och förvaras i rumstemperatur för långvarig användning.
2. Baserat på den önskade sammansättningen av geler som ska syntetiseras, beräkna (med hjälp av ett kalkylprogram som Microsoft Excel) vikten av polymer och crosslinker behövs. Eftersom en viss vikt av polymer måste lösas upp i en definierad totala volymen för att uppnå en önskad koncentration i hydrogel, den crosslinker och polymer delar lösning av den totala gel volymen måste också bestämmas med hjälp av kalkylark. Liknande beräkningar bör göras om något hängande beståndsdelarna (t.ex. en självhäftande RGD eller YGSR innehåller oligopeptide) skall införlivas före crosslinking.
3. Väg erforderlig mängd polymer och crosslinker och placera i Eppendorf-rör. Justera beräkningen kalkylblad följaktligen för den faktiska vikten som erhålls av polymer. (Notera: volymerna kan ändras för att kompensera för den faktiska massan erhålls av polymera och crosslinker).
4. Förbered gel formar med hjälp av ett rakblad för att skära av toppar off individuellt förpackade sterila 1 ml engångssprutor. Säkerställa en platt sågas för formar som ska användas för photopatterned geler.
5. Lägg sprutan formar, Eppendorf-rör (med lock är öppet) och alla andra nödvändiga material under ett bakteriedödande ljuskälla (vanligen inbyggd i Biologiska säkerhetsskåp) och sterilisera i 30 minuter.

B. cellberedningen

1. Efter sterilisering, tillsätt lämplig steril buffert volym (per kalkylblad beräkningar, medan valet av buffert kan variera, PBS och en svag bas buffert som t.ex. trietanolamin används vanligtvis för fri radikal och Michael-typ crosslinking respektive) till polymeren Eppendorf och (valfritt) hängsmycke fraktion som ska ingå (t ex lim peptid) och skaka för att lösa upp (om vortexa utanför sterila huven linda Eppendorf med parafilm).
2. Lägg till lämplig volym av hängande fraktionen lösningen till polymeren lösningen och linda tätningen med parafilm. Kortfattat virvel och inkubera vid 37 ° C för att reagera (om möjligt, på toppen av en roterande rör platta) under cellberedningen. Detta innebär att reaktionen från en tiol på en peptid (via cystein gruppen) till en akrylat eller metakrylat så att peptid ingår som ett hänge grupp i finalen hydrogel.
3. Trypsinize och räkna celler och separat i portioner som innehåller rätt antal för varje uppsättning geler. Till exempel för en uppsättning av tre 50 mikroliter geler vid en densitet på 10 miljoner celler / ml, separat 1500 tusen celler i en enskild koniska rör. Det rekommenderas att inte mer än 4 geler beredas i en enskild som på grund av tidpunkten för gelation (OBS: Om syntetisera flera uppsättningar geler, kan en enda Eppendorf innehåller en tillräcklig mängd polymer lösning för alla apparater vara beredd).
4. Centrifugera cellerna.
5. Medan cellerna snurrar ner
   1. Ljus inlett fria radikaler crosslinking: lägg till 0,5 vikt% I2959 lösning till polymeren lösningen motsvarar 10% av den totala gel inställda volymen (för en slutlig initiativtagare koncentration på 0,05 vikt%).
   2. Michael-typ (tillägg) crosslinking: Lägg bufferten till crosslinker för att uppnå lämplig koncentration lösningen.
   3. För sekventiell crosslinking: dessa geler innehåller båda typerna av crosslinking och kräver båda föregående stegen.

C. Hydrogel Bildning

1. Sug ut supernatant från centrifugeras cellen delen. Vänta tills vätskan att bosätta sig efter första aspiration och åter aspirera ta bort så mycket material som möjligt utan att störa cellpelleten.
2. Resuspendera cellpelleten med polymer lösning tills cellerna är jämnt fördelade. Minimera bubblor bildas genom att långsamt pipettera lösningen upp och ner (ca 10 cykler bör vara tillräckligt för att fördela celler).
3. Crosslinking Hydrogeler
   1. Ljus inlett fria radikaler crosslinking: Alikvotera lämplig volym i formar sprutspetsen. Exponera sprutor för UV-ljus för radikala crosslinking (t.ex. en 10 minuters exponering till 365 nm, är 4 mW/cm2 UV-ljus vanligt akrylat functionalized polymerer). Detta steg ska utföras snabbt för att minimera cell lösa innan UV-ljus exponering.
   2. Michael-typ (tillägg) crosslinking: Med en bred öppning pipettspets, tillsätt lämplig mängd crosslinker lösning på polymer / cellen lösning, ställ in pipetten till önskad enskilda gelen volym, pipettera lösningen upp och ner förhomogenisera och uppmätt in formarna sprutspetsen. Detta steg ska utföras snabbt för att säkerställa en jämn fördelning av celler. Låt 10-30 minuter (beroende på det enskilda systemet) inkubering i kulturen huva för crosslinking.
   3. Sekventiell crosslinking: Detta innebär att Michael-typ förutom reaktion först och sedan exponering för ljus för den andra crosslinking. Endast en bråkdel av teoretisk antipyridinantikropp bör reagerade under den första crosslinking och sedan en steril mask bör appliceras direkt på gelen yta innan ljusexponering använda steriliserad pincett. En functionalized färgämne (t.ex. methacrylated Rhodamine (MeRho) till en slutlig koncentration i gelen på 20 nm) kan också läggas till den initiala lösningen för att visualisera mönster, eftersom det kommer att införliva företrädesvis i radikalt tvärbunden regioner i gelen (figur 2 ).

D. cellkultur och Analys

1. Efter crosslinking, kasta geler i brunnar i en vävnadsodling skylt som innehåller medier för inkubering och analys (se följande steg).
2. Celler kan visualiseras för morfologi med ljusmikroskop (Figur 3, typiskt, syntetiseras hydrogeler är transparenta) och lönsamheten med hjälp av en fluorescerande live / döda fläckar kit (figur 3 och 4). Färgning för cellulära aktin (t.ex. Rhodamine eller fluorescein märkt phalloidin) och kärnor (t ex, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) kan utföras med vanliga fixering och förfaranden permeabilization (Figur 4) med följande procedur.
   1. Skölj konstruktioner 3X i 5 minuter med PBS.
   2. Fix geler genom inkubering i 1 ml 4% formaldehyd i 30 minuter vid rumstemperatur.
   3. Skölj konstruerar 3X med blockerande lösningen innehåller 3% (w / v) BSA och 0,5% (w / v) Tween i PBS.
   4. Permeabilize membran med 0,25% (w / v) Triton X i blockerande lösningen i 20 min.
   5. Skölj konstruerar 3X med blockerande lösningen.
   6. Stain för F-aktin med 0,66 mikrogram / ml FITC eller Rhodamine phalloidin i blockerande lösningen under två timmar vid rumstemperatur.
   7. Skölj 3x med blockerande lösningen.
   8. Fläck cellulära kärnor med 0,4 mikroliter / ml DAPI i PBS i 20 min.
   9. Skölj 3X med PBS.
   10. Visualisera celler med epifluorescent eller konfokalmikroskopi.
3. Tillväxt av celler i geler brukar utvärderas med hjälp av kommersiellt tillgängliga analysmetoder (t.ex. totala DNA eller biokemiska innehåll). PicoGreen är ett vanligt använt och känslig fluorescerande nukleinsyra fläcken för kvantifiering av dubbelsträngat DNA (Singer et al.). Celler kan också räknas och normaliseras till en första kontroll nummer med hjälp av visualisering metoder som beskrivs i steg 2.
4. Histologisk snittning och färgning kan också användas för att visualisera celler och bildade matrisen. Följande protokoll för uttorkning och sektionering av 3D hydrogeler kan användas för att få fram tvärsnitt skivor på glas diabilder:
   1. Fixering och dehydrering
      1. Skölj provet 3X i PBS.
      2. Fix för 5 - 30 minuter i 4% paraformaldehyd.
      3. Skölj provet 3X i PBS.
      4. Inkubera provet i EtOH vid 25 ° C i 1 timme vid vart och ett av följande EtOH (v / v) i vatten (i ordning): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% Vid denna punkt (, prover kan lagras över natten vid 25 ° C).
   2. Clearing och Infiltration
      1. Transfer till 100% Citrisolv i 1 timme vid 25 ° C, följt av en timme vid 65 ° C.
      2. Skär prover i halv med ett rakblad i en petriskål så att tvärsnittet av provet utsätts för.
      3. Överföring till 1:1 blandning av Citrisolv / Micro-cut Paraffin för 1 timme vid 65 ° C.
      4. Transfer till 100% Micro-cut Paraffin för 1 timme vid 65 ° C.
      5. Transfer till 100% Micro-cut paraffin över natten vid 65 ° C.
      6. Transfer till 100% Micro-cut Paraffin i 1-2 timmar vid 65 ° C.
   3. Bädda in
      1. Placera provet i Peel-away mögel med 100% paraffin.
      2. Placera en liten mängd vax i mögel sängen, och sätt de två halvorna av provet med tvärsnittet nedåt.
      3. Applicera toppen filter bit
         1. Lägg till ytterligare vax för att dränka den övre delen och låt härda i ~ 10 minuter.
      4. Överföring skär till 4 ° C kylen så att exemplaret härda över natten.
      5. Provet kan sektionenED följande dag, vanligtvis på 5-10 ìm tjocklek per segment med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikrotomer. Typiskt skal-away mögel monteras vertikalt mot mikrotomen scenen och manuella kontroller används för att ställa avsnittet tjocklek, skivare och justering av provet med bladet.
   4. RNA-extraktion
      
      Genuttryck kan också bedömas kvantitativt (t.ex. via realtid polymeraskedjereaktion (PCR)). Protokollet för RNA-extraktion från 3D hydrogeler, ett exempel som återges nedan, är helt annorlunda från det mycket enklare 2D-fallet.
      1. Etikett en certifierad RNAse gratis Eppendorf-rör för varje 3D-hydrogel och lägga till 500 mikroliter Trizol ® reagens i varje rör.
      2. Använd en mortelstöt (vävnad grinder) för att manuellt slipa hydrogeler tills en klar lösning erhålls. Se till olika slipmaskiner används för varje tillstånd.
      3. Vortex varje Eppendorf i 20 sekunder för att homogenisera proverna.
      4. Inkubera prov i rumstemperatur i fem minuter för att tillåta fullständig dissociation av nukleoprotein komplex.
      5. Cool prover på is i 20 minuter
      6. Tillsätt 200 mikroliter (per ml Trizol) kloroform till varje prov och skaka.
      7. Inkubera prov i rumstemperatur i fem minuter.
      8. Centrifugera prover 12.000 xg vid 4 ° C i 15 min.
      9. Överför vattenfasen (klar översta lagret) till nya Eppendorf-rör (för att undvika gränskiktsvetenskap regionen och lägre rött, fenol-kloroformfasen). RNA kvar i den klara vattenfasen.
      10. Vanliga tekniker för RNA-isolering och lagring kan nu användas.
      11. Efter RNA-extraktion, kommersiellt tillgänglig kit för omvänt transkriptas och realtids-PCR används ofta med vissa modifieringar (Elisseff et al. Strehin et al.).

Representativa resultat:

Se figur 2-4 (som refereras till i ovan nämnda protokoll) för representativa resultat för visualisering av photopatterned hydrogeler och inkapsling av celler i geler.

Figur 1. Översikt över 3D inkapsling förfarande. Diagram steg motsvarar Rubrikerna i en stegvis protokoll.

Figur 2. Photopatterned hydrogel med sekventiella Michael-typ förutom då radikalpolymerisation. (A) Schematisk bild av photopatterning av en delvis tvärbunden hydrogel med införlivandet av ett foto reaktiv färgämne. (B) cirkel eller (C) rand OH-film mask mönstrade hyaluronsyra hydrogel. Methacrylated Rhodamine (MeRho) ingår bara i de regioner i gel som utsattes för ljus. Skala bar = 100 ìm.

Figur 3. Visualisering av celler i 3D hydrogel. Stamceller visualiseras via (a) ljusmikroskop eller (b) levande (grön, kalcein AM) och döda (rött, Ethidium homodimer-1) färgning 24 timmar efter inkapsling till 1 miljon celler / ml i en hyaluronsyra hydrogel tvärbunden genom ett ljus initieras fria radikaler mekanism. Skala bar = 100 ìm.

Figur 4. Visualisering av celler i 3D hydrogel. hMSCs färgas för (a) Levande celler (kalcein AM) eller (b) cellulär aktin (Rhodamine phalloidin) och kärnor (DAPI) fem dagar efter inkapsling till 1 miljon celler / ml i en hyaluronsyra hydrogel tvärbunden genom en Michael-typ mekanism ( med hjälp av peptider pendel lim och bifunktionell proteolytically nedbrytbar bindemedel peptid). Skala bar = 100 ìm.

Discussion

Den beskrivna protokollen utgör en enkel och kraftfull metod för att kapsla in celler i hydrogel ställningar på ett cytocompatible sätt. Sådana tekniker är speciellt viktigt eftersom obotligt differentierade och stamceller kan uppvisa helt olika beteende i 2D kontra 3D mikromiljöer. Även för terapeutiska metoder som innebär implantation av material (t.ex. in situ radikalpolymerisation), cell inkapsling och analys för livskraft och differentiering kan hjälpa till i materialet utvecklingsprocessen. Den beskrivna sekventiella processen kan användas för att rumsligt manipulera hydrogel miljön, och följaktligen cellulära beteende (se Khetan et al.).

Totalt sett är den mest kritiska delen av de beskrivna protokoll homogenitet av allt använt lösningar. I synnerhet bör särskild försiktighet vidtas för att säkerställa cellerna är jämnt fördelade i prepolymer lösning och att lösningen är väl blandat med pipett resuspension följande tillägg av crosslinker lösningen. Underlåta att säkerställa detta kan leda till klumpar av celler eller lokala variationer i gel struktur och svullnad.

Medan de protokoll som presenteras här fokuserar främst på förfarandet för att kapsla in celler är det viktigt att notera också att inkapsling kan göra det nödvändigt viss anpassning till analys protokoll som vanligtvis är skrivna för 2D sådd. Flera exempel illustrerades för att visualisera och bedöma celler i hydrogel.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
.2 M Triethanolamine Buffer	Reagent	Sigma-Aldrich	T0449
PBS	Reagent	Invitrogen	14040-117	1x, sterile liquid
Live/Dead staining kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes
Phalloidin-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	P5282
Rhodamine Phalloidin	Reagent	Invitrogen	R415
DAPI	Reagent	Sigma-Aldrich	D9542
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)	Reagent	Polysciences, Inc.	23591
Bovine Serum Albumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A7030
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Citrisolv	Reagent	Fisher Scientific	22-143975
Micro-cut paraffin	Reagent	Polysciences, Inc.	24202
Trizol reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026
0.22 μm pore size nylon syringe filters	Equipment	Fisher Scientific	09-719C
1 mL disposable syringes	Equipment	BD Biosciences	309602	Cut syringes at consistent height for UV exposure
Wide orifice pipette tips	Equipment	Sigma-Aldrich	P6800
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter	Equipment	EXFO	S1000
254 nm germicidal UV light source	Equipment			Built into most biological safety cabinets