En snabb hög kapacitet metod för kartläggning Ribonucleoproteins (RNPs) om mänskliga pre-mRNA

Summary

På grund av övergående natur pre-mRNA, kan det vara svårt att isolera och studera

Abstract

Sekvensering RNA att samarbetet immunoprecipitate (co-IP) med RNA-bindande proteiner har ökat vår förståelse för skarvning genom att visa att bindande platsen ofta påverkar funktionen av en skarvning faktor. Men som med alla provtagningsstrategi chansen att identifiera en RNA bunden till en skarvning faktor är proportionell mot dess cell överflöd. Vi har utvecklat en ny in vitro metod för kartläggning bindande specificitet för övrigt övergående pre-mRNA. Denna metod använder en särskilt utformad oligonukleotid pool som kakel över introner, exoner, korsningar skarva eller andra pre-mRNA. Poolen är utsatt för någon form av molekylära urval. Här visar vi metoden genom att separera oligonukleotiden in i en bunden och obundna fraktionen och använda en två strategiska färg array för att registrera anrikning av varje oligonukleotid i den bundna fraktionen. Matrisen uppgifter ger upphov till högupplösta kartor med förmåga att identifiera sekvensspecifika och strukturella determinates av ribonucleoprotein (RNP) bindande för pre-mRNA. En unik fördel med denna metod är dess förmåga att undvika provtagning inriktning mot mRNA i samband med dagens IP och tekniker SELEX, eftersom poolen är särskilt utformade och syntetiseras från pre-mRNA sekvens. Flexibiliteten i oligonukleotiden poolen är en annan fördel eftersom försöksledaren väljer vilka regioner att studera och kakel över, sömnad poolen till deras individuella behov. Med denna teknik kan en analys av effekterna av polymorfismer eller mutationer på bindande i stor skala eller klona biblioteket till en funktionell skarvning reporter och identifiera oligonukleotider som anrikas i den medföljande fraktion. Denna nya in vitro högupplösta kartläggningssystem erbjuder ett unikt sätt att studera RNP interaktioner med övergående pre-mRNA arter, vars låga överflöd gör dem svåra att studera med dagens in vivo tekniker.

Protocol

Pool design och oligo återhämtning

1. Det första steget är att utforma den pre-mRNA poolen ska studeras. Detta kan göras med hjälp av UCSC Genome Browser och ladda ner vissa gener, korsningar skarva, eller andra områden av intresse.
2. När fönstren av intresse har valts ut, kakel över dem via dator med hjälp av följande villkor: läs längd bör vara 30 nukleotider med en 10 nukleotid överlappar därför varje oligo förskjuts 20 nukleotider från tidigare en. * Oligo överlappning bör ökas i anslutning till skarva webbplatser för att säkerställa tillräcklig täckning, öka överlappningen 10 till 20 nukleotider kan åstadkomma detta.
3. Flank varje 30-nukleotida oligo med universell primer sekvenser, som kommer att användas för att förstärka poolen nedströms. Kaklat oligo order lämnas till Agilent, där sekvenser ska skrivas ut på en egen oligonukleotid microarray.
4. Att återvinna DNA oligos från microarray ytan börjar genom att placera bilden utbud locket i en array hybridisering kammare och försiktigt pipettera 500 mikroliter av dH ₂ O på bilden
5. Sandwich arrayen ovanpå locket bilden noga med att undvika luftbubblor som kan störa processen. Se till att placera arrayen ansiktet nedåt så att sidan med oligos vidrör vattenytan. En bra tumregel är "Agilent berör Agilent", vilket betyder att Agilent etiketten på matrisen står inför Agilent etiketten på locket bilden
6. Stäng hybridisering kammaren och vrid över natten vid 99 ° C i en hybridisering ugn
7. Följande dag, försiktigt bort arrayen från kammaren och dra ut vattnet, som nu innehåller oligos befriats från arrayen ytan. Detta är oligo poolen
8. Placera poolen i ett 1,5 ml Eppendorf-rör och låt ligga vid poolen i 50% amplitud för 3-5 sekundpulser
9. Därefter förstärka pool av låg cykel PCR, med hjälp av universella primers med en T7-tagg läggs till i slutet. För den första omgången, denaturera vid 94 ° C under 1 minut, glödga vid 55 ° C i 20 sekunder och elongate i 1 minut vid 72 ° C. För efterföljande rundor gör 10 sekunder, 20 sekunder och 10 sekunder vid respektive temperatur, med en slutlig förlängning steg i 5 minuter vid 72 ° C. Eftersom antalet cykler som krävs för att förstärka poolen beror på effektiviteten av oligo återhämtning kan det vara nödvändigt att prova flera cykel nummer. Var noga med att inte över-förstärka poolen, som kännetecknas av en kladdig band på en akrylamid gel. PCR-amplifierade prover kan förvaras vid 4 ° C tills det behövs.
10. Det sista steget i oligo förberedelse är att transkribera RNA med MEGAshortscript ™ Kit från Ambion. * Följande protokoll har anpassats från Ambion
    1. Tina T7 10x Reaktionsbufferten, fyra ribonukleotid lösningar och vatten vid rumstemperatur samtidigt som T7 Enzyme Mix på is
    2. Montera reaktionsblandningen i en RNase-fri mikrocentrifugrör vid rumstemperatur. Komponenter av reaktionen bufferten kan orsaka templat-DNA att fälla om reaktionen är blandad på is.
    3. I följande ordning, pipett 3 mikroliter nukleasfritt vatten, 2 mikroliter av 10x reaktionen bufferten, 2 mikroliter av varje 75 mm NTP lösning, 5 mikroliter av templat-DNA (PCR amplifieras oligo pool) och 2 mikroliter av T7 enzym, för en slutlig volym av 20 mikroliter
    4. Flick röret försiktigt för att blanda reaktionen sedan snabbt samla upp i mikrofug blandningen på botten av röret.
    5. Inkubera reaktion i en termocykler vid 37 ° C i 2 timmar. Inkubationstiden är mall-beroende, därför kan det vara nödvändigt att använda en tid-kurs experiment för att bestämma den optimala inkubationstiden för maximal avkastning
    6. Efter 2 timmar, ta bort mallen DNA genom att tillsätta 1 mikroliter av Turbo DNase till reaktionen och inkubera vid 37 ° C i ytterligare 15 minuter
    7. Avsluta reaktionen och återvinna RNA med fenol / kloroform extraktion och etanol nederbörd.
       1. För en 20 mikroliter reaktion volym, lägga 115 mikroliter av dH ₂ O och 15 mikroliter av 3 M natriumacetat till reaktionen.
       2. Blanda väl tillsätt sedan 75 mikroliter av sura fenol och 75 mikroliter av kloroform. Blanda lösningen genom att vortexa, sedan mikrofugrör för en minut vid 13.000 rpm vid rumstemperatur. Överför vattenskiktet till ett nytt rör och upprepa extraktionen
       3. Överför vattenskiktet till ett nytt rör och tillsätt 150 mikroliter av kloroform. Vortexa blandningen och centrifugera som tidigare. Överför vattenskiktet till ett nytt rör.
    8. Återvinn RNA genom att lägga två volymer av 100% kall etanol till vattenskiktet och blanda väl. Chill blandningen i minst 15 minuter vid -20 ° C centrifugera sedan vid 4 ° C i 15 minuter med högsta hastighet till pellets RNA. Ta försiktigt bort supernatanten och suspendera pelleten i 105 mikroliter av 0,1 x Tris-EDTA (TE) buffert ..
11. Det är svårt att ta bort alla fria nukleotider från T7 Kit reaktion, så för de mest korrekta resultat, kvantifiera RNA med hjälp av RiboGreen.
    1. Till att börja kvantitering, först späda nog 1x TE, 2300 mikroliter + 50μL/sample.
    2. Därefter gör RiboGreen. Du kommer att behöva 1000 mikroliter + 50 ml / prov. För hög räckvidd prover (1 mikrogram / ml till 20 ng / ml) Blanda RiboGreen 1:200 i 1x TE, för det låga prover (50 ng / ml till 1 ng / ml) Blanda RiboGreen 1:2000 i 1x TE ; Tillsätt 50 mikroliter av RiboGreen lösning i varje brunn på en ogenomskinlig plattan, börjar med A1 och flytta ner, inte över
    3. Späd en RNA-stamlösningen till 2 mikrogram / ml för högt utbud prover eller 100 ng / mikroliter den lägsta kategorin prover
    4. Med hjälp av stamlösningen, skapa en standard kurva genom sex efterföljande 01:02 spädningar av den ursprungliga 2 mikrogram / ml eller 100 ng / mL materiel; Pipettera 240 mikroliter av beståndet till en PCR-band rör. I de återstående 7 rör, pipettera 120 mikroliter av 1x TE. Ta 120 mikroliter från RNA beståndet väl, och blanda med slang 2. Ta 120 mikroliter från tub 2 och blanda med slang 3. Upprepa tills tuben 7. Tube 8 kommer endast att ha TE och kommer att vara din tomt. Tillsätt 50 mikroliter av standardkurvan lösningar till de dunkla plattan, A1: H2 (kör kurvan två gånger)
    5. I en ny tub, blanda 45 mikroliter av TE med 5 mikroliter av oligo poolen och lägga till alla 50 mikroliter till en brunn som innehåller 50 mikroliter av RiboGreen.
    6. Med hjälp av en plattläsaren ställa in maskinen för att läsa fluorescens från toppen efter en en-minuters mix med en excitation våglängd på 485 nm och utsläpp våglängd på 530 nm och läs plattan
    7. Använd standardkurvan genereras för att kvantifiera det återvunna RNA, som bör förvaras vid -20 ° C.

Co-immunoprecipitation av oligo poolen med en RNP av intresse

1. Innan du påbörjar samarbete immunoprecipitation, förbereda Protein A och Protein G Dynabeads från Invitrogen genom att blanda dem i förhållandet 1:1 upp till en slutlig volym på 50 mikroliter per reaktion. Till exempel för två reaktioner lägger du till 50 mikroliter var och en av varje pärla.
2. Använd en magnetisk separering stå så här en från Novagen att hålla kulorna på plats medan du tar bort supernatanten och tvätta pärlor två gånger med en lika stor volym kallt 1x PBS
3. Efter den andra tvättar, resuspendera pärlor i en lika stor volym kallt 1x PBS och tillsätt 2 ng av antikroppen per reaktion. Detta belopp kan variera beroende på antikroppar, så experimenterande är nödvändigt för att hitta den optimala förhållanden.
4. Inkubera antikropp / pärlan blandningen över natten vid 4 ° C på en roterande plattform
5. På morgonen, tillsätt 2 mikrogram per reaktion av sonicated RNA jäst totalt att blockera icke-specifik bindning, och rotera i ytterligare 30 minuter vid 4 ° C.
6. Med hjälp av magnetiska rack för att hålla kulorna, avlägsna supernatanten och tvätta kulorna två gånger med kallt 1x PBS, lämnar PBS från den andra tvättar i röret.
7. Ta ut nya rör, ett för varje reaktion och alikvot 50 mikroliter av kornet blandningen i varje rör. Låt kulorna sitter samtidigt förbereda en Master Mix
8. För varje reaktion lägga 200 ng av oligo pool, en ekvimolära förhållandet skydd primer, 2 mikrogram sonicated jäst totala RNA, 20 mikroliter av HeLa nukleära extrakt (detta är RNP källa), och bufferten E för att få upp volymen till 120 mikroliter. Skyddet primers RNA versioner av universella primers. Beställ transkription mallar för den samhällsomfattande primers med en T7-tagg läggs till i slutet, sedan transkribera RNA från mallarna använder MEGAshortscript ™ Kit.
9. Avlägsna supernatanten från pärla alikvoter och återsuspendera pärlor i 120 mikroliter av Master Mix. Rock the reaktioner vid 4 ° C i 1-2 timmar.
10. Efter inkubation, för varje reaktion, ta bort ett litet delprov (inklusive pärlor) för en "total" RNA-prov
11. Placera resten av reaktionerna på magnetisk separering stå och ta bort supernatanten. Även om det inte är nödvändigt att analysera denna genomströmning prov nedströms, kan det vara bra att spara.
12. Tvätta pärlor 1-2 ggr med 50 mikroliter av kall 1x PBS. RNA bundet till antikroppen på pärlor är "IP" prov.
13. Resuspendera "totalt" och "IP" pärlor i 50 mikroliter av 1% SDS i 0,1 x TE buffert och värme proverna vid 65 ° C i 15 minuter för att eluera RNA.
14. Avlägsna supernatanten, som nu innehåller RNA som tidigare var bundna till pärlor och ren med fenol / kloroform extraktion följt av en etanol nederbörd. Torka av pellets och återsuspendera den i 50 mikroliter 0,1 x TE buffert.

Omvänd transkription och förstärkning av samarbete IP prover inför aminoallyl märkning

1. Därefter måste RNA-proverna omvänd transkriberas och PCR förstärks. För omvänd transkription reaktionen används omvänd universella primers.
2. För varje prov, börja med att blanda 1 ìldet omvända universell primer, med 1 mikroliter av mallen RNA (från immunoprecipitation reaktion) och 10 mikroliter av dH ₂ O. Värm reaktioner vid 70 ° C i 5 minuter sedan chill på is eller hålla vid 4 ° C.
3. Medan proverna svalt, göra följande Master Mix. För varje reaktion kombinera 4 mikroliter av 10 mm dNTPs, 2 mikroliter av 10x Arrayscript buffert, 1 mikroliter RNase hämmare och 1 mikroliter omvänd transkription enzym. Blanda väl och tillsätt 8 mikroliter av Master Mix till varje omvänd transkription reaktion.
4. Använd en PCR-maskin för att inkubera proverna vid 42 ° C i 2 timmar, följt av 95 ° C i 5 minuter och 4 ° C tills de prover som behövs för förstärkning.
5. Efter omvänd transkription av RNA-prover, PCR förstärka dem med hjälp av universella primers, med en av de primers som innehåller en T7 tagg. Antalet cykler som behövs för att förstärka poolen kommer att bero på effektiviteten i det samarbete IP så kan det vara nödvändigt att prova flera omgångar. Varje reaktion kräver 5 mikroliter av 10x Taq reaktion buffert, 0,2 mikroliter av varje grundfärg (100 mm), 1 mikroliter av cDNA mallen (från omvänd transkription reaktion), 1 mikroliter av 10 mm dNTPs, 42,2 mikroliter av dH ₂ O, och 0,4 mikroliter av Taq enzym.
   
   Börja PCR genom att inkubera proverna vid 94 ° C i 3 minuter. Därefter för varje cykel, denaturera vid 94 ° C i 45 sekunder, glödga vid 55 ° C i 30 sekunder och elongate vid 72 ° C i en minut, med en slutlig töjning vid 72 ° C i 10 minuter.
6. Därefter transkribera proverna igen med MEGAshortscript ™ Kit, men den här gången tillsätt 2 mikroliter av aminoallyl UTP, istället för T7 UTP. Den aminoallyl UTP kommer att användas för att märka RNA med Cy färgämnen.
7. Fenol / kloroform och etanol fällning proverna. Använd INTE Glycoblue eller ammoniumacetat, kan båda stör hybridisering av proverna till arrayen. Torka pelleten och återsuspendera i 4,5 mikroliter av 0,1 M natriumkarbonat.

Amino-allyl märkning av RNA med Cy Färgämnen

1. Till att börja märkning protokollet upplösa varje fluorescerande färger, cy3 och Cy5 i 45 mikroliter av DMSO. För att undvika ljus, linda rören i aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C i mörker
2. Tillsätt 2,5 mikroliter av nukleasfritt vatten till RNA prover och blanda väl
3. Lägg sedan till 3 mikroliter av Cy3 till "total" prov, och 3 mikroliter av Cy5 till "IP" prov. Inkubera proverna i mörker i en timme i rumstemperatur, The Cy-3 prov blir röd eller rosa medan Cy-5 blir blå.
4. För att avsluta reaktionen, lägg 6 uL 4 M hydroxylamin-HCl till varje prov, blanda noga och spin kort. Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur.
5. Rena märkta prover av fenol / kloroform extraktion följt av etanol nederbörd och återsuspendera pelleten i 50 mikroliter av 0,1 x TE

Hybridisera prov till microarray med Agilent Kit Array hybridisering

1. Börja hybridisering genom att försiktigt blanda 50 mikroliter av 10x blockerande buffert, 140 mikroliter av nukleasfritt H2 _O, 25 mikroliter av Cy3-märkt "totalt" pool, 25 mikroliter av Cy5 märkt "IP" pool, 10 mikroliter av 25x fragmentering buffert och 250 mikroliter av 2x hybridisering buffert, ta hand för att undvika att införa bubblor. Mikrofugrör provet en kort stund för att samla in lösningen i botten av röret och även att minska bubblor.
2. Placera o-ringen täcker bilden i hybridisering kammaren och försiktigt pipettera lösningen på bilden.
3. Placera upptäckt rad ovanpå locket bild till "sandwich"-lösningen. Kom ihåg att orientera arrayen bilden så att Agilent etiketten på matrisen står inför Agilent etiketten på locket bilden.
4. Kläm bilden / Array smörgås i hybridisering kammare och rotera vid 50 ° C i 3 timmar.
5. Medan matrisen roterar, gör följande 50 ml lösningar i 50-ml koniska rör: en konisk fylld med 50 ml dH ₂ O, två 1x SCC buffertlösningar, var i ett separat rör och en 2x SCC buffert.
6. Efter tre timmars inkubation, noggrant unclamp arrayen / skjut smörgås och placera den i 50 ml koniska innehåller 2x SCC buffert. Med hjälp av en pincett försiktigt skilja arrayen från locket bilden och dra ut locket bilden. Var noga med att inte röra arrayen som bilden är utdragen. Stäng koniska och vänd försiktigt i 60 sekunder.
7. Med hjälp av pincett, överföring arrayen till 1x SCC lösningen, mössa röret, och försiktigt vändas i 1 minut sedan överföra arrayen till den andra 1x SCC-lösning och igen sakta vända för en annan minut.
8. Slutligen, överföring arrayen till tub dH ₂ O och vänd försiktigt i 30 sekunder.
9. Torka arrayen genom att kanterna på bilden på en Kimwipe. Fortsätt att rotera arrayen på torka noga med att inte störa den sida som innehåller oligos.
10. Placera den torra array ien tom 50-ml koniska rör och skanna med en microarray skanner

Tolka Microarray

1. Den microarray Skannern kommer att skapa en TIF-bild av matrisen. Kör den här bilden genom Agilent feature extraction programvara, med hjälp av rutnätet filen (levereras av Agilent) som är unikt för just din pool.
2. Den Agilent programvaran kommer att tolka signalen på varje funktion för att skapa en fil, som analyseras med en Perl-skript. Signalen vid varje funktion är normaliseras till den totala intensiteten på den kanalen. Till exempel vid en viss funktion i den gröna kanalen, är intensiteten i den gröna kanalen för den enskilda funktionen dividerat med den totala intensiteten av den gröna kanalen över alla funktioner. Den slutliga utgången är loggen förhållandet mellan den röda kanalen över den gröna kanalen vid varje funktion på matrisen.
3. Den oligo poolen data från microarray åter kan mappas tillbaka till genomet för att få en bild av var och hur starkt det RNP av intresse bunden.

Figur 1. Experimentell schematisk

A. Plattsättning systemet. Efter att ha valt och hämta pre-mRNA sekvenser av intresse är att välja område kaklade igenom i 30 nukleotid fönster som förändring i 10 nukleotid steg. Universell grundfärg bindningsställen flanken var sida om fönstret.

B. Syntes Array. Kaklat oligo order lämnas till Agilent, där sekvenser ska skrivas ut på en egen oligonukleotid microarray.

C. Co-immunoprecipitation. Efter att koka oligos utanför arrayen, inkubera i HeLa nukleära extrakt, lägg sedan till extraktet till magnetiska kulor som är förberedd med en antikropp mot RNP av intresse. Märk börjar oligo poolen med Cy3 och den bundna IP-pool med Cy5 och gäller för upptäckt array och skanna.

Figur 2. Kommentera genomet med och analys av anrikning data.

A. Konvertera den genomsnittliga poängen på varje genomisk samordna från arrayen data base-tio logga och karta som poäng till den givna koordinater. En illustration av detta genomsnitt steg ges i 3 överlappande 30-nt oligos med massor av 2, 4 och 0,5, där den genomsnittliga anrikning poäng för varje 10-nt fönstret ritas ovan. Den valda genomiska regioner kan visualiseras med hjälp av en anpassad bana i USCS Genome Browser. Exemplet webbläsarfönster som ges är i clta genen, där genen funktioner (exoner / introner / alternativ splitsning etc.) ges längs botten och logga genomsnittlig poäng anrikning från PTB-bundna oligos representeras av mörkt röda vertikala streck. PTB binder starkt strax uppströms exon 2 i polypyrimidine tarmkanalen.

Discussion

När du gör detta förfarande det viktigt att komma ihåg att skapandet av poolen är flexibel och öppen för förändring antingen RNA eller protein nivå. Vid RNA-nivå orthologous regioner, mutationer sjukdom, polymorfismer, eller slumpmässiga mutationer kan föras in i oligonukleotid sekvensen. På proteinnivå RNA-bindande faktorn kan ändras genom fosforylering eller andra inlägg translationella modifieringar. Dessutom kan bindande miljö manipuleras för att antingen öka eller minska nivåerna av ytterligare faktorer som samverkar eller konkurrerar med RNA-bindande protein av intresse.