Summary
電位感受性色素は、その単一細胞から複数の神経節の回路への範囲は調整可能な解像度と、そのようなモルモット腸神経系の神経叢としてそのままニューラルネットワークからの電気活動の光学的記録を有効にする方法このプロトコルは示しています。
Abstract
腸神経系（ENSは）分離して複雑な動作を行うことのできる識別機能を持つ自己完結型のネットワークです。その神経細胞（直径10〜25μmであるが）腸壁の異なる平面に限定されている神経叢に配置されています
Protocol
パート1：組織の準備
- 粘膜下と筋層間神経叢の調製物は、150〜200グラム（旧2〜3週間）イソフルラン吸入と首を切り落としたことで麻酔されているHartleyモルモットの小腸からの順次解剖によって分離されています。安楽死の後、小腸を切除し、その内容は、暖かい、酸化溶液とルーメンをフラッシュすることによって除去される。我々は、25 mMのHEPESを添加した培地199、5mMのNaHCO 3及び2mMのグルタミンを使用し、37℃で事前に暖められている7.4（M199 - DMとして、今から、参照される）に調整pHを、℃、プロトコルのすべての残りのステップは、しかし、室温で実施される。
- 腸セグメント、長さ8〜10 cmは、腸間膜の国境沿いにオープンしたM199 - DMを、含むSylgard皿に移し、そして虫ピンを使用して粘膜側を上向きにマウントされています。それは、組織を固定した後、定期的に整列粘膜絨毛の行を持つ長方形の形状を示すように、さらに緊張を維持することは非常に重要です。
- ほぼ水平の位置で、ストレートチップの微細デュモンの鉗子を使用して、それは準備の一端に絨毛をつかみ、組織の縦軸に沿って引いて粘膜剥離が容易である。サンプルが均一に固定されているときは、粘膜のリボンは、粘膜下神経節と粘膜下血管系を含む粘膜下層を露出、いくつかの個々のストロークで分離することができる。
- 神経叢の細かい解剖では、暗視野照明と解剖顕微鏡を使用することをお勧めします。確かに、照明のこのタイプで作成された擬似三次元効果は、それによって楽器に負わせた損害を防止または最小化、個々の層を区別するのに役立ちます。
- 粘膜下準備をするために、我々が必要とハーストとマッキディー4の古典的な手順に従います。）円形の筋線維の方向に続く粘膜下層にカットしているのか、これは（このようなモリアのような非常に微細なハサミを用いて達成することができますMC19またはそれに相当する）、b）の微細なハサミを使ってダウン円形の筋層を押しながら、微細な鉗子で非常に穏やかに粘膜下を持ち上げ、分離は、残りの部分から粘膜下層を解放するために進むにつれてc）は長手方向の縁に沿って切断準備は、d）は粘膜下準備の最終的なサイズを定義するために、最初からの距離にある円形の筋線維の方向に続くセカンドカットとなっています。わずか30〜50μmの厚さであり、クモの糸のような外観を持っている結果として粘膜下のセグメントは、、、M199 - DM新鮮含む別のSylgard皿に移し、優しくして緊張せずに固定され、後で使用するために酸素チャンバーで保持することができます。
- オリジナルの腸セグメントは、現在、粘膜および粘膜下層を奪われ、円形の筋肉が露出して、それでも筋層間神経叢の準備を生成するために使用することができます。筋層間神経叢を公開するためには、できるだけ多く輪筋層の可能な限り排除する必要があります。これは、前のステップで用いられる同じストレートチップ微細な鉗子を使用することによって達成することができます。繊維の束は、最初からして、準備の反対側から、静かに引き出すことができます。露出筋層間神経叢は、筋肉と基礎漿膜の長手方向の層から分離することはできません。したがって、と呼ばれるものが筋層間神経叢の準備は、ピンに沿って切断することができますセグメントです。それはライブの筋肉が含まれているので、それは生理学的実験が開始されるまで酸素M199 - DMを含む皿の中で非常に緩く、それを固定することをお勧めします。
- 粘膜がメインENSセンサーであり、すべてのエフェクターも腸壁に埋め込まれているので、それは全体の反射経路を保持する半無傷の準備を分析することが可能です。これらのカスタム設計の準備が1.3で説明した手順の組み合わせを必要とする。 1.6〜。、分離された腸管セグメントの隣接する領域に適用される。
- 数分前に実際の光の実験に、選択の準備は、テンションが均等に分散し、組織がSylgardの底に完全に平らにされていることを確認して、実験室内に搭載されている。これは、組織のダメージを与えることなく、すべての周囲に配置することができる複数の非常に微細なピンで試料を保持することによって達成されます。
第2部：光記録のための組織サンプルの調製
- （オプション）残留平滑筋や結合組織に結合する色素からバックグラウンド蛍光を防ぐために、両方の分離された神経叢は、コラゲナーゼVII（≤50 U / ml）およびプロテアーゼIX（≤0.5μgを含むM199 - DMで30〜60分間インキュベートすることができる/ ml）を。で、、準備が血清（例えば、ウマやウシ）と抗生物質（ストレプトマイシン、100μg/ mlのペニシリン、100U/ml）で洗浄し、そしてで一晩維持、M199 - DMプラス10％の動物れるべき酵素治療後チャンバーはwiを飽和目95％O 2および5％CO 2。それが顕著に光学録音の信号対雑音比を向上させるため、我々は長年使用しているこの手順では、、初心者には役立つことができない場合がありますので、注意して採択されるべきである。実際、解剖中に破損した準備は酵素処理の間に崩壊の危険性を実行します。しかし、酵素治療の非存在下で、我々は準備が血清と抗生物質でM199 - DMで一晩維持されることをお勧めします。このステップでは、急性解離の損傷後の組織の治癒を促進し、そしてサンプルの透明性を向上させます。
- 電気活動の光学的記録は、筋肉が収縮している準備のために達成することはできません。前に我々はM199 - DM入浴組織に2μMのニフェジピンを追加する光学実験に筋層間神経叢、数分から録音するとき、したがって、筋肉の収縮を防止する。
パート3：ジ- 4 - ANEPPDHQで染色
- ジ-4 ANEPPDHQは、凍結乾燥形態で市販されている。我々は[例えば、15〜20 mg / mlの]濃厚原液を作り、純粋なエタノールに溶解することをお勧めします。この株は、-20℃で保管するときに、非常に安定しています。確かに、私たちの研究室では、我々は、私たちが、ほぼ6年前に作ったこの色素のストック溶液の最後の一滴を終えた。
- 染色液は、M199 - DMで準備する必要があります、とプロトコルがそれを必要とする場合は2μMのニフェジピンが含まれている必要があります。染料の最終濃度は5μg/ mlのように低くすることができますし、50μg/ mlのよりも大きくすべきではない。しかし、株式の濃度に応じて、エタノールの一定量は、染色液に存在するであろうし、考慮する必要があります。例えば15 mg / mlストックから作られる場合、染料の濃度50μg/ mlの染色液は0.3％のエタノールが含まれるが、ほぼ1％のエタノールへの株式は5 mg / mlの濃度を持っていた場合。
- 染色のために、準備は色素溶液で10〜30分間、浸漬される。その期間が過ぎると、色素が洗い流されており、新鮮で置き換え、M199 - DM酸素。ジ-4 ANEPPDHQだけ脂質環境における蛍光を発する細胞膜非透過性の色素であるため、染色された腸の準備から健康なニューロンは、空のバルーンの外観を持つ必要があります。
第4部：電気的刺激
- 刺激は、電圧または電流によって駆動することができます。我々は、チャネルあたり16mAの最大出力をコンピュータ制御によって供給される電流刺激、、4チャンネルの刺激発生器を使用してください。
- 与えられた実験で使用する電極のモデルは、実験の目的によって決定されます。目標は、特定のニューロンの刺激のときに細胞内のピペットまたはパッチ電極を使用することができます。刺激が与えられた神経節内の複数のニューロンを活性化することを意図されている場合、結合に触れる細胞外電極を用いてもよい。相互神経節、大規模で低抵抗の電極および/または多素子の電極アレイを採用することができるを検討するために、しかし、我々は一般的に行うように電流刺激を使用する場合は、多素子アレイは、唯一の選択肢となる。細胞外電極の多くのモデルだけでなく、いくつかの線状電極アレイは、商業的供給源から容易に入手可能である。
- 電極はマイクロマニピュレータの異なるタイプを使用して位置決めすることができます。長いと細かいバレルによって誘発される振動を避けるために、我々は実験室に隣接して配置できる磁気拠点に小さなマニピュレーターを使用し、薄くても非常に剛性の金属棒でタングステン電極の柔軟なバレルを支持する支持する。
パート5：灌流
我々一酸化ソリューションの入力のためのチャネル、および出力の他に2チャンネル蠕動ポンプを使用してください。灌流によって誘発される機械的な障害を排除するために、ポンプは、光データの取得中に、オフになっています。
第6部：膜電位の複数のサイト光記録のための装置
- 光学部品：
膜電位の複数のサイト光記録用の装置は、NeuroCCD - SMカメラ（RedShirtImaging）と正立顕微鏡の三眼鏡筒に取り付けられた1時10分demagnifier /リレーレンズで構成されています。顕微鏡は、厳格に、アクティブ除振テーブルの上に固定されているステージとは独立して、XYのトランスレータに移動します。空気中の振動を最小限に抑えるために、装置全体が重い音響のカーテンとマイラーの屋根に囲まれています。落射照明は、超低リップルのフィードバック安定化電源を搭載100Wタングステンハロゲンランプによって提供されます。入射光は、熱のフィルタ、高Q干渉フィルター（HQ530/50）および565 nmの（50％透過）ダイクロイックミラーを用いた準単色になります。蛍光発光は、ダイクロイックミラーとロングパスフィルタ（HQ572LP）を使用して分離される。 INTEN入射光のsityは、NDフィルターを使用して調整されます。準備の明視野観察用のトランスイルミネーションは、特別な属性を持つことが必要とされていない0から55 V、10から10の電源によって駆動される第2 100 Wタングステンハロゲンランプによって提供されます。 - 高速度カメラの仕様：
電子設計とNeuroCCD - SMのカメラの性能特性は、詳細3に記載されている。簡単に言えば、それは、裏面入射型、裏面照射型マルコーニCCD39 - 01チップ（80 × 80ピクセル）を使用する高精度、高速カメラ冷却、低解像度です。デジタル化は14ビットであり、フルフレームレートは2 kHzです。しかし、特定の目的のために、人は様々なビニングの組み合わせを使用または機能のピクセルの数を減らすことによって、最大10 kHzの最大フレームレートを高める可能性があります。カメラは非常に低い読み出しノイズ（; 1 kHzで9電子2kHzで23電子）の重要な利点があります。さらに、そのピクセルは、高フレームレートで適度な光強度を許可する、（215000電子）が比較的大きいもの深さを持っている。 - データ収集と解析ソフトウェア：
光学実験はNeuroplex、IDLプラットフォーム（インタラクティブデータ言語）内のアプリケーションとして動作し、光学的データの取得、表示および分析のために必要な複数の機能が含まRedShirtImagingから、ソフトウェアパッケージによって制御されます。 - 追加のカメラ：
装置の不可欠な部分、フレームグラバーに接続した二番目の、高解像度CCDカメラ上に顕微鏡のリレーの準備の画像の三眼ヘッドのビームスプリッタとして。買収およびグローバルラボのイメージ/ 2ソフトウェアを使用して格納されているイメージは、、の空間的な起源の正確な地図を生成するためにNeuroCCD - SMのカメラで撮影したサブミリ秒時間分解光信号の表示に重畳することができます光学的に電圧信号を記録した。私たちの研究室では、このカメラのためのフレームグラバは、機能的なデータ収集の責任とは別のコンピュータに常駐。そのため、イメージファイルがあるコンピュータから別のコンピュータに転送する必要があり、2台のカメラの完全な登録が達成される前に、高解像度の画像の大きさと位置の微調整が必要です。
パート7：光学実験
- 前に、各機能の録音に、我々は（6.4に示されているように）光学的手段により電気的活動を記録することを計画した地域の高解像度の白黒画像を得る。この画像は、高速度カメラのピクセルマップの上に重なったときに、私たちは光信号の源である構造を識別するのに役立ちます。
- 適切なシステム構成では、Neuroplexは（6.3参照）もシャッターを制御し、電気刺激をトリガーします。高速データ収集は、大量のコンピュータパワーを必要とするので、それは大量のメモリと大容量ハードディスクドライブを専用のコンピュータを使用するために、可能なら、お勧めです。ことは、しかし、容易ではありません。当社独自のシステム、たとえば、すでに数年前には、最先端のコンピュータに適合するには大きすぎるデータ集録ボードを採用しています。妥協案として、我々は採用し、私たちの光学系に500 GBハードドライブと4 GBのRAMを搭載のDell Precision 390を捧げた。それでも我々の実験を実行するのに十分な電力を供給しながら、このコンピュータでは、私たちはA / DおよびD / Aボード、私たちは古いが、十分に保つことができました。
- とすぐに買収が終わると、Neuroplexは以下に詳述されているそのうちの一部、複数の補完的なフォーマットで結果を、表示することができます。
- 画面の領域は、個々のフレームとして80 × 80ハイスピードカメラで撮影したとして、ページの表示は準備の原油画像を示して呼ばれる。台目のカメラ（のような6.4と7.1で説明）で取得した高解像度の画像のこのピクセルマップ上に重ね合わせ、関心のある分野を特定する演算能力を洗練する。
- このページのディスプレイの画素は、マウスの制御下で選択されている場合、Neuroplexは自動的に時間の関数として、これらのピクセルによって登録された光学的変化の大きさを示すトレースに彼らの光出力に変換します。 （例えば、ΔF/ F対時間）。オペレータはこれらのトレースは、個々のピクセルの出力、または、むしろ、準備の所定の領域上に複数の遺伝子座の空間平均出力を反映するかどうかを決定することができます。
- データはまた、映画の形式で表示することができます。
個々の実験の実行に含まれるすべての情報が完全に抽出されることを保証するために、しかし、我々は、光データのオフライン分析を好む。この分析の代表的な結果が利用可能です。
パート8：光学実験で技術的な品質を達成する方法
目光学実験の電子技術的成功は、録音の信号対雑音比によって、最終的に、測定されます。さらに、良好な信号対雑音比は、エピファニーからではなく、旅からではない茎。オペラ公演のように、最終的な結果は、相乗的に相互作用する因子の多重度によって決定されます。したがって、技術的に健全な光学実験を達成するために、それは、独立して、光学装置とプロトコルの各ステップに必要なスキルを洗練することが不可欠です。以下は、潜在的な問題-地域のリストであり、常に5を予想していない問題を回避するためのいくつかの提案：
- ノイズ源
常に生理学的反応を反映してわずかな変化（ΔF/ F）は（<10％/腸の録音のほとんどでは100 mV）比較的小さいため、電位感受性色素との電気的活動を記録し、ノイズの多いトレースするときに機械的および光学的安定性が重要である悪い結果をaugurs。したがって、信号対雑音比を最適化するために、それは排除する、または、少なくとも、二つの最悪の犯罪者の寄与を最小限に抑えることが不可欠です。）機械的振動、およびb）光源の変動。- 機械的振動は、セットアップの設定、安定性、電動機器、空気流、音響ノイズ、流体の運動、または入浴液中に浮遊する粒子の近接性を構築するなど、多様なさまざまな情報源によって生成されます。優れた振動絶縁システム、および極端な場合のためのアコースティックカーテンは（例えば、5.1の説明を参照）、大きな違いを生むともそのコストの価値がある。さらに、このような実験で使用したソリューションのろ過、またはセットアップの小さい、可動部品の磁気塩基の使用など、常識的なアプローチは、非常に効果的です。
- 光源は、準最大強度で最も安定しています。したがって、一つは電源の電流制限を設定する必要があります、そして、必要なときに、電圧を減らすことによって、光パスの代わりに中立密度のフィルタを挿入することにより、光強度を減少させる。アークランプは、本質的に騒々しいです。タングステンハロゲン電球や発光ダイオードは、はるかに安定しており、好ましい選択さである必要があります。
- 動物の年齢
年齢とともに腸のtoughens内結合組織として、それは、その求心性および遠心性のプロセスが2つの神経叢の神経細胞、に大きなダメージを与えることなく、個々の組織層を分離するために、より困難になる、ので、解剖は、若い動物の腸を使用して実行する必要がありますクロス層の境界および/または腸の長手軸に沿ってかなりの距離のためのプロジェクト。内神経節の接続を検討する際に無視することができるこのアドバイザリは、、実験的な目的は間神経節回路または反射経路の活性化の分析のときに最も重要である。 - 色素のインター
できるだけ低い色素濃度として使用すること、および不必要な光の露出を最小限にすることが重要です。ジ-4 ANEPPDHQは他の染料よりもはるかに小さい光毒性であることが証明されていますが、準備の健康が悪化するとして、それは、最終的には、内在化されることになります。染料内在化は、バックグラウンド蛍光3飛躍的に増加させることにより信号対雑音比を減少させる。 - 電極のメンテナンス
- 電極は、それぞれの実験の後、慎重かつ徹底的に洗浄する必要があります。タングステン電極の先端の有機堆積物は、電極抵抗を増加させ、刺激を防ぐ。
- 市販のタングステン電極の絶縁は、非常に繊細でダメージを受けやすいです。断熱材のリーク電流シャント、刺激の有効性が損なわれ、実験の成功を危うくなります。
- 灌流危険
灌流がオンのときにセットアップを無人のまま放置しない。のフローと蠕動ポンプのアウトフローが適切にバランスされていない場合は、2つの致命的なイベントが行われる場合があります。- 洪水は、顕微鏡に不可逆的な損傷を与える可能性があります。
- 準備は、実験中に完全に乾くことがあります。
- ソフトウェアの激論
それは、買収だけでなく、解析を制御するソフトウェアで自分を理解することが不可欠です。高速データ収集および/または非常に大きなファイルの作成は、内訳の瀬戸際にシステムを駆動する傾向があり、その境界条件が尊重される限り、かなり厳しいですNeuroplexは、、容赦なくクラッシュしてしまいます。分析が関心の限られた地域に限定されている場合は見逃しやすいレコード内の微妙な点は、しばしばデータの動画表示に姿を現す。
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Discussion
このプロトコルは、二つの目標を念頭に書かれています。最初のものは、過去10年間の多くの技術的進歩、電位感受性色素を用いて電気的活性の光記録のおかげで無傷の神経ネットワークを研究するための最も強力な、信頼性と手頃な方法論の一つとなっている、という他の研究者を説得することです。確かに、それは簡単に控えめなリソースを持つ実験室でも実装することができます。第二の目標は2つの神経叢とその生物学的な出力の電気的挙動と分子や細胞のイベントを相関するためのユニークな実験モデルとして、腸神経系を促進することである。
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Acknowledgments
私達は私達が私たちと彼の技術的な専門知識を共有するための2光子ビデオの冒頭に示されている画像、およびH.高野を取得するために彼の2光子顕微鏡を使用できるようにするためのDAコールターを（CHOP）に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
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- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
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- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
