Summary
Этот протокол иллюстрирует, как напряжение чувствительных красителей позволяет оптическая запись электрической активности из целых нейронных сетей, таких как сплетений морской свинки кишечной нервной системы, с регулируемой резолюцию, которая варьируется от одной клетки до нескольких ганглиозные схемы.
Abstract
Кишечной нервной системы (ENS) является автономным сети с определенными функциями, способные выполнять сложные поведения в изоляции. Ее нейроны (от 10 до 25 мкм в диаметре) расположены в сплетений, которые ограничены различных плоскостях стенки кишечника
Protocol
Часть 1: подготовка ткани
- Подслизистого сплетения и myenteric препараты изолированных путем последовательного вскрытия из тонкого кишечника в 150-200г (2-3 неделя) Хартли морских свинок, которые были под наркозом на изофлуран вдыхании и обезглавили. После эвтаназии, тонкой кишки вырезали и его содержимое удаляется промывкой просвет с теплым, насыщенный кислородом раствор. Мы используем Средний 199 дополнена с 25 мМ HEPES, 5 мМ NaHCO 3 и 2 мМ глютамина, и рН до 7,4 (идет речь, с этого момента, как M199-DM), который был предварительно нагревают при 37 ° C. Все остальные действия протокола, однако, будет осуществляться при комнатной температуре.
- Кишечного сегмента, 8-10 см в длину, переносится на блюдо Sylgard содержащие M199-DM, открыли по брыжеечной границе, и установлен слизистой стороной вверх использованием насекомых булавками. Это чрезвычайно важно поддерживать даже напряженность, так что после закрепления ткани экспонатов прямоугольной формы с рядами слизистой ворсинок регулярно выровнены.
- Использование тонких щипцов Дюмон с прямыми советами, в почти горизонтальном положении, легко чистить, захватывая слизистой оболочки ворсинок на одном конце подготовки и трогания с места вдоль продольной оси ткани. Когда образец равномерно возлагали, ленты слизистой оболочки могут быть разделены на несколько отдельных мазков, выставляя подслизистой, который содержит подслизистом ганглиев и подслизистых сосудов.
- Для тонкой рассечение сплетений, мы рекомендуем использовать рассекает микроскоп с темного поля освещения. Действительно, псевдо-трехмерный эффект, созданный этим типом освещения помогает отличить отдельных слоев, тем самым, предотвращения или минимизации приборостроения причиненного ущерба.
- Для того, чтобы подслизистого подготовки, мы следуем классической процедуры Херст и Мак-Кирди 4, который требует: а) сделать разрез в подслизистом слое следующие ориентации круговых мышечных волокон, что может быть достигнуто с помощью очень тонких ножниц (таких, как Мории MC19 или его эквивалент), б) поднятие подслизистой очень мягко с тонким пинцетом, во время нажатия круговой мышечный слой вниз, используя ножницы штраф в) разрезанием вдоль продольных краев, как разделение прогрессирует и приводит к освобождению подслизистой от остальной части приготовительный, г), что делает второй разрез следующие ориентации круговые мышечные волокна на некотором расстоянии от первого, для определения окончательного размера подслизистого подготовки. В результате подслизистого сегменте, который находится всего от 30 до 50 мкм и паутинка внешний вид, может быть передано другому блюду Sylgard содержащие свежие M199-DM, возлагали мягко и без напряжения, и хранятся в кислородом камере для последующего использования.
- Оригинальные кишки сегмента, в настоящее время лишены слизистой оболочки и подслизистой, и с круговой мышцы подвергаются, все еще может быть использован для выхода myenteric подготовки сплетения. Чтобы разоблачить myenteric сплетения, нужно ликвидировать как можно больше круговой мышечный слой. Это может быть достигнуто с помощью той же прямой наконечник тонкой щипцы, занятых в предыдущих шагах. Пучков волокон можно вытянуть аккуратно прочь, то с одной, а затем с другой стороны подготовки. Подвергается myenteric сплетения не может быть отделена от продольный слой мышечной и серозной основной. Поэтому то, что называется myenteric подготовки сплетение сегмент, который можно разрезать по булавки. Потому что он содержит живые мышцы, желательно контактный очень свободно в блюдо с кислородом M199-DM до физиологического эксперимента начинается.
- Поскольку слизистая оболочка главного датчика ENS, и все эффекторы также встроенные в стенки кишечника, можно препарировать полу-нетронутыми препаратов, сохранить все рефлекторные пути. Эти специально разработанный подготовка требует сочетания действия, описанные в п. 1.3. до 1,6., примененная к смежные области изолированных кишечного сегмента.
- За несколько минут до фактического оптического эксперимента, подготовка выбор устанавливается в экспериментальной камере, чтобы убедиться, что напряжение равномерно распределяется и ткани лежит абсолютно плоской против нижней Sylgard. Это достигается путем проведения образца с несколькими очень тонкие булавки, которые могут быть размещены по всему периметру, не причиняя повреждения тканей.
Часть 2: Подготовка образцов ткани для оптической записи
- (Необязательно) Чтобы предотвратить фона флуоресценции красителя привязки к остаточной гладких мышц и соединительной ткани, как изолированные сплетений может быть инкубировали в течение 30-60 мин в M199-DM содержащие коллагеназы VII (≤ 50 МЕ / мл) и протеазы IX (≤ 0,5 мкг / мл). После обработки ферментом препараты должны быть вымыты, и поддерживается в течение ночи в, M199-DM плюс 10% животного сыворотки (например, лошадей или крупного рогатого) и антибиотики (пенициллин, 100U/ml, стрептомицин, 100 мкг / мл), в Камера насыщенных шго 95% O 2 и 5% СО 2. Эта процедура, которую мы использовали в течение многих лет, потому что заметно улучшает отношение сигнал-шум оптические записи, не может быть полезно для начинающих, так и должно быть принято с осторожностью. В самом деле, подготовка поврежден во время вскрытия рискует распадаться во время обработки ферментом. Однако, даже в отсутствие фермента лечение, мы рекомендуем, чтобы подготовка сохранится в течение ночи в M199-DM с сывороткой и антибиотиками. Этот шаг способствует заживления тканей после острого повреждения вскрытия, а также увеличивает прозрачность образца.
- Оптическая запись электрической активности не может быть достигнут в подготовке, в котором мышца сокращается. Поэтому, чтобы предотвратить сокращение мышц при записи с myenteric сплетения, за несколько минут до оптического эксперимента мы добавляем 2 мкМ нифедипина для M199-DM купания ткани.
Часть 3: Окрашивание с ди-4-ANEPPDHQ
- Ди-4-ANEPPDHQ коммерчески доступен в лиофилизированной форме. Мы рекомендуем растворив его в чистом этаноле, что делает концентрированный раствор акции [например, 15-20 мг / мл]. Эта акция, когда хранится при температуре -20 ° С, чрезвычайно стабильной. Действительно, в нашей лаборатории, мы только что закончили последней капли маточного раствора этого красителя, что мы сделали почти 6 лет назад.
- Окрашивание раствора должна быть подготовлена в M199-DM, и должны содержать 2 мкМ нифедипина если протокол требует этого. Конечной концентрации красителя может быть как 5 мкг / мл и не должна быть выше, чем 50 мкг / мл. Однако, в зависимости от концентрации акций, определенное количество этанола будет присутствовать в красящим раствором и должны быть приняты во внимание. Например, окрашивание раствора с 50 мкг / мл красителя будет содержать ~ 0.3% этанол, если из 15 мг / мл акции, но близко к 1% этанола, если акция была концентрация всего 5 мг / мл.
- Для окрашивания, подготовки погружена в течение 10-30 минут в раствор красителя. По истечении этого срока, краситель смывается и заменена свежей, насыщенной кислородом M199-DM. С ди-4-ANEPPDHQ является мембрана-impermeant краситель, который флуоресцирует только тогда, когда в липидной среде, здоровые нейроны от окрашенных кишечных подготовка должна иметь вид пустых воздушных шаров.
Часть 4: Электростимуляция
- Стимуляция может управляться напряжением или током. Мы используем текущий стимуляции, выступил с компьютерным управлением, 4-канальный стимул генератор с максимальной мощностью 16 мА на канал.
- Электрод модели, которые будут использоваться в данном эксперименте определяется экспериментальной задачей. Внутриклеточное пипетки или патч электродов можно использовать, когда целью является стимулирование частности нейрона. При стимуляции предназначен для активации более одного нейрона в данном ганглии, внеклеточных электродов трогательные соединительной могут быть использованы. Для изучения соединительные узлы, крупные, низкоомных электродов и / или многоэлементные массивы электродов могут быть использованы, однако, при использовании текущей стимуляции, как мы обычно делаем, многоэлементных массивы стать единственным вариантом. Многие модели внеклеточных электродов, а также некоторых линейных массивов электрода, которые легко доступны из коммерческих источников.
- Электроды могут быть размещены с использованием различных видов микроманипуляторами. Для того чтобы избежать вибрации индуцированных длинный и тонкий баррелей, мы выступаем с использованием малых микроманипуляторами на магнитных баз, которые могут быть расположены рядом с экспериментальной камеры, а также поддержка гибкой баррелей вольфрамовые электроды с тонкой, но очень жесткий металлический пруток.
Часть 5: перфузии
Мы используем 2-канального перистальтического насоса с одним каналом для ввода атмосфере кислорода, а другой для вывода. Для устранения механических нарушений индуцированных перфузии, насос выключенным во время приобретения оптических данных.
Часть 6: Аппарат для нескольких сайтов оптической записи мембранного потенциала
- Оптические компоненты:
Аппарат для нескольких сайтов оптической записи мембранный потенциал включает в себя NeuroCCD-SM камеры (RedShirtImaging) и 1:10 demagnifier / реле объектив установлен на тринокулярный трубку прямой микроскоп. Микроскопа движется по переводчика XY, независимо от стадии, жестко крепится к верхней части таблицы активной виброизоляции. Чтобы свести к минимуму вибрацию воздуха, весь аппарат окружен тяжелые шторы акустических и майлара крышей. Эпи-подсветка обеспечивает 100 Вт вольфрамо-галогенной лампы питается от ультра-низким пульсации обратной связи источника питания стабилизировались. Падающего света производится квазимонохроматических использованием тепла фильтром, высокой добротностью интерференционный фильтр (HQ530/50) и 565 нм (50% передач) дихроичных зеркал. Флуоресценция выбросов отделяется с помощью дихроичных зеркал и долго фильтра (HQ572LP). Интенсивностиинтенсивность падающего света регулируется с помощью фильтры нейтральной плотности. Транс-подсветкой, для светлого поля просмотра подготовки обеспечивается второй 100 Вт вольфрамо-галогенной лампы обусловлен 0-55 V, 1-10 блок питания, который не обязан обладать специальными атрибутами. - Высокоскоростная камера спецификации:
Электронных дизайн и технические характеристики NeuroCCD-SM камеры были подробно описаны 3. Одним словом, это охлаждается, низкое разрешение, точность высокоскоростной камерой, которая использует резервные поредели, задней подсветкой Маркони CCD39-01 чипа (80х80 пикселей). Оцифровка является 14-разрядным, и с полной частотой кадров составляет 2 кГц. Тем не менее, для конкретных целей, можно увеличить частоту кадров до максимум 10 кГц при помощи различных комбинаций биннинга или сокращение числа функциональных точек. Камера имеет важное преимущество крайне низкой читать шума (23 электронов на 2 кГц, 9 электронов на частоте 1 кГц). Кроме того, его пиксели имеют относительно большие глубины скважины (215 000 электронов), что позволяет умеренной интенсивности света при высокой частоте смены кадров. - Устройства сбора данных и программное обеспечение для анализа:
Оптическом эксперименте контролируется Neuroplex, пакет из RedShirtImaging, которая работает как приложение в платформу IDL (Interactive Data Language) и включает в себя множество функций, необходимых для приобретения, отображения и анализа оптических данных. - Дополнительная камера:
Как составная часть аппарата, светоделитель на тринокулярный глава микроскопом реле образ подготовку на втором, с высоким разрешением ПЗС-камеры, подключенной к раме-граббер. Изображение, которое приобретается и сохраняется с использованием Глобальной Лаборатории Изображение / 2 программное обеспечение, могут быть наложены на дисплее под мс с временным разрешением оптических сигналов, захваченных NeuroCCD-SM камеры для получения точной карты пространственного происхождения оптически записали сигналы напряжения. В нашей лаборатории, захвата кадров для этой камеры заключается в том компьютере, один отвечает за функциональную сбора данных. Таким образом, файл образа должен быть передан с одного компьютера на другой, и небольшие изменения в размеры и положение изображения с высоким разрешением требуется до идеально регистрации две камеры достигается.
Часть 7: Оптические эксперименты
- Перед каждой функциональной записи, мы приобретаем высокое разрешение в черно-белое изображение области, из которой мы планируем запись электрической активности оптическими средствами (как указано в 6.4). Этот образ, когда накладывается на пиксель-карту высокоскоростной камерой, помогает нам определить структуры, которые являются источником оптических сигналов.
- В соответствующей конфигурации системы, Neuroplex (см. п. 6.3) также управляет затвором и триггеры электрической стимуляции. С высокой скоростью сбора данных требует значительных вычислительных ресурсов, желательно, если это вообще возможно, чтобы использовать выделенный компьютер с большим объемом оперативной памяти и жесткий диск большой емкости. Это, однако, не является тривиальной. Наша собственная система, например, уже несколько лет, работают сбора данных плат, которые слишком велики, чтобы уместиться в состоянии современных компьютеров. В качестве компромисса мы приняли и посвящен наш оптической системы Dell Precision 390 оснащен 500 ГБ жестким диском и 4 Гб оперативной памяти. Этот компьютер позволил нам сохранить наши старые, но адекватный, A / D и D / платы, сохраняя при этом достаточную мощность для запуска наших экспериментах.
- Как только приобретение закончилась, Neuroplex может отображать результаты в нескольких дополнительных форматов, некоторые из которых приведены ниже:
- Области экрана называется страница дисплей показывает грубый образ препарат в качестве захвачен 80x80 высокоскоростной камерой, как отдельного кадра. Наложение на этот пиксель-карту изображения с высоким разрешением, полученные с второй камерой (как описано в 6.4 и 7.1) уточняет возможность оператору с до выявления областей, представляющих интерес.
- Когда пикселей этого отображения страницы выбираются под управлением мышью, Neuroplex автоматически преобразует их в оптические выходы следы, которые показывают величину оптического изменения зарегистрированы те пиксели, как функция времени. (Например, f / F в зависимости от времени). Оператор может решить, являются ли эти следы должны отражать продукции отдельных пикселей, или, точнее, пространство-усредненный вывод нескольких локусов над данной области подготовки.
- Данные также могут быть отображены в фильме-формате.
Чтобы гарантировать, что вся информация, содержащаяся в отдельных экспериментальных работает полностью извлечен, однако, мы выступаем за обработки и анализа оптических данных. Представитель результаты этого анализа доступны.
Часть 8: Как добиться технического качества в оптическом эксперименте
Thэлектронных технических успех оптическом эксперименте измеряется, в конечном счете, отношение сигнал-шум записей. Кроме того, хорошее отношение сигнал-шум происходит не из-прозрение, но от поездки. Как и в исполнении оперы, конечный результат определяется множеством факторов, которые взаимодействуют синергически. Таким образом, для достижения технически обоснованных оптическом эксперименте, необходимо уточнить, независимо, оптических приборов и навыки, необходимые для каждого шага протокола. Ниже приводится список потенциальных неприятностей, районах, а также некоторые предложения, как избежать проблем, не всегда ожидаемых 5:
- Источники шума
Механические и оптические стабильности имеют решающее значение при записи электрической активности с напряжением чувствительных красителей, так как относительное изменение (f / F), отражающий физиологические реакции относительно мала (<10% / 100 мВ в большинстве кишки записей) и шумных следа всегда предвещает плохой исход. Поэтому, чтобы оптимизировать сигнал-шум-отношения, крайне важно, чтобы устранить или, по крайней мере, свести к минимуму, вклады два худших преступников: а) механические колебания, и б) колебание света источника.- Механические колебания генерируются разнообразные источники, как разнообразны, как и настройки конфигурации, укрепления стабильности, близость моторизованного оборудования, воздушных течений, акустический шум, движение жидкости, или частицы, плавающие в растворе ванны. Хорошие вибрации изоляция системы и акустические шторы для крайних случаях (см., например, описание в 5.1), иметь большое значение и заслуживают их стоимости. Кроме того, здравый смысл подходов, таких как фильтрации растворов, используемых в эксперименте, или использование магнитных базы для маленьких, подвижных частей установки, являются достаточно эффективными.
- Источники света являются наиболее устойчивыми в квази-максимальной интенсивностью. Таким образом, следует положить текущий предел для питания, и, при необходимости, уменьшить интенсивность света, вставив нейтральной плотности фильтров в свете путь, а не за счет снижения напряжения. Дуговые лампы неразрывно шумно. Вольфрам-галогенные лампы или светодиоды намного более стабильным и должно быть предпочтительным выбором 6.
- Животное возраста
Вскрытия должно быть сделано с помощью кишечнике молодняка, поскольку, как соединительной ткани в кишечнике ужесточает с возрастом она становится все более трудно отделить отдельных слоев ткани, не причиняя серьезный вред нейронам два сплетения, чьи афферентных и эфферентных процессов может крест границ слоя и / или проекта в течение достаточно расстояния вдоль продольной оси кишки. Эта консультативная, которые могут приниматься во внимание при изучении внутри-ганглиозные соединений, имеет первостепенное значение при экспериментальной целью является анализ взаимодействия ганглиозные схем или активация рефлекторных путей. - Dye интернализации
Важно, чтобы использовать как низкие концентрации красителя насколько это возможно, и свести к минимуму ненужного воздействия света. Хотя ди-4-ANEPPDHQ оказалось гораздо меньше, чем в других фототоксических красителей, он получит внутреннее, в конце концов, как здоровье подготовки ухудшается. Dye интернализации уменьшается отношение сигнал-шум, увеличивая значительно фоновой флуоресценции 3. - Электрод обслуживание
- Электроды следует мыть осторожно и тщательно после каждого эксперимента. Органические отложения на концах вольфрамовые электроды увеличения сопротивления электродов и предотвратить раздражение.
- Изоляция коммерчески доступных вольфрамовый электрод является очень тонкой и склонной к повреждениям. Утечки в изоляции будет шунт тока, поставить под угрозу эффективность стимуляции и поставить под угрозу успех эксперимента.
- Перфузии опасности
Никогда не оставляйте настройки без присмотра во время перфузии включен. Если в потоке и вне потока перистальтического насоса должным образом не сбалансирована, двух катастрофических событий может иметь место:- Наводнение может привести к необратимому повреждению микроскопом.
- Препарат может иссякнуть в ходе эксперимента.
- Программное обеспечение суеты
Важно, чтобы ознакомиться с программным обеспечением, которое управляет приобретения, а также анализа. Быстрый сбора данных и / или создание очень больших файлов, как правило, диск система на грани распада, и Neuroplex, что вполне неумолимый, рухнет, если ее безжалостно граничные условия соблюдаются. Тонкости в записи, легко пропустить, когда анализ ограничивается ограниченных областей интересов, часто проявляют себя в кино проявления данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол был написан с двумя целями в виду. Первое, чтобы убедить других исследователей, что благодаря многих технологических достижений последнего десятилетия, оптическая запись электрической активности с использованием напряжения чувствительных красителей стала одной из самых мощных, надежных и доступных методик для изучения нетронутыми нейронных сетей, в действительности , она может быть легко реализованы даже в лаборатории, имеющие скромные ресурсы. Вторая цель заключается в содействии кишечной нервной системы как уникальная экспериментальная модель, в которой для корреляции молекулярных и клеточных событий с электрическим поведение двух нейронов сплетений и их биологической выходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Д. Коултер (CHOP) за предоставленную нам возможность использовать его 2-фотонного микроскопа приобрести 2-фотонного изображения показан в начале видео, а также Х. Такано для поделился с нами своими техническими знаниями.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M.
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
