Optische opnemen van elektrische activiteit in Guinee-pig Enteric Netwerken met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen

Summary

Dit protocol laat zien hoe voltage-gevoelige kleurstoffen optische registratie van de elektrische activiteit in staat stellen uit intacte neurale netwerken, zoals de plexuses van de cavia enterische zenuwstelsel, met een instelbare resolutie die varieert van enkele cellen om multi-ganglion circuit.

Abstract

Het enterisch zenuwstelsel (ENS) is een op zichzelf staand netwerk met geïdentificeerde functies, in staat om het uitvoeren van complexe gedragingen in een isolement. De neuronen (10 tot 25 micrometer in diameter) zijn gerangschikt in plexus die zich beperken tot verschillende vlakken van de darmwand

Protocol

Deel 1: Tissue voorbereiding

1. De submukeuze en myenterische plexus voorbereidingen zijn geïsoleerd door opeenvolgende dissectie van de dunne darm van 150-200g (2-3 weken oud) Hartley cavia's die verdoofd zijn door isofluraan inademing en onthoofd. Na de euthanasie, is de dunne darm uitgesneden en de inhoud ervan verwijderd door spoelen van de lumen met een warme, zuurstofrijke oplossing. We maken gebruik van Medium 199 aangevuld met 25 mM HEPES, 5 mM NaHCO ₃ en 2 mM glutamine, en de pH ingesteld op 7,4 (waarnaar wordt verwezen, van nu af aan, als M199-DM), die is voorverwarmd bij 37 ° C. Alle overige stappen van het protocol, zal echter worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
2. Een intestinale segment, 8-10 cm in lengte, is overgebracht naar een Sylgard schotel met M199-DM, geopend langs de mesenteriale grens en gemonteerd mucosa side-up met behulp van insect pinnen. Het is uiterst belangrijk om ook spanning, zodat na pinning het weefsel een rechthoekige vorm vertoont met de rijen van mucosale villi regelmatig uitgelijnd.
3. Met behulp van fijne Dumont tang met rechte tips, in een bijna horizontale positie, is het gemakkelijk te pellen van de mucosa door grijpen de villi aan de ene kant van de voorbereiding en trekken weg langs de lengteas van het weefsel. Wanneer het monster gelijkmatig is gespeld, kunt linten van mucosa worden gescheiden in een paar individuele slagen, het blootstellen van de submucosa dat de submukeuze ganglia en de submucosale bloedvaten bevat.
4. Voor de fijne dissectie van de plexus, raden we het gebruik van een dissectiemicroscoop met donker-veld verlichting. Inderdaad, de pseudo drie-dimensionale effect gecreëerd door deze vorm van verlichting helpt te onderscheiden van de afzonderlijke lagen, waardoor het voorkomen of minimaliseren instrument toegebrachte schade.
5. Om een submucosale voorbereiding, volgen we de klassieke procedure van Hirst en McKirdy ⁴ dat vereist: a) het maken van een snede in de submucosale laag naar aanleiding van de oriëntatie van de circulaire spiervezels, dit kan worden bereikt met behulp van zeer fijne schaar (zoals een Moria MC19 of een equivalent), b) het opheffen van de submucosa heel voorzichtig met de fijne tang, terwijl het duwen van de cirkelvormige spierlaag omlaag met de fijne schaar, c) snijden langs de longitudinale randen als de scheiding vordert de submucosa bevrijden van de rest van de prep, d) het maken van een tweede snede na de oriëntatie van de circulaire spiervezels op een afstand van de eerste, tot de uiteindelijke grootte van de submucosale voorbereiding te definiëren. De resulterende submucosale segment, die slechts 30 tot 50 um dik en heeft een ragfijne uitstraling, kan worden overgedragen aan een andere Sylgard schotel met verse M199-DM, gespeld zacht en zonder spanning, en bewaard in een zuurstofrijke kamer voor later gebruik.
6. De originele gut-segment, die nu verstoken van mucosa en submucosa, en met de kringspier blootgesteld, kan nog steeds worden gebruikt om een ​​myenterische plexus voorbereiding opleveren. Bloot te leggen van de myenterische plexus, moet men elimineren zo veel mogelijk van de circulaire spierlaag. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van dezelfde rechte-tip fijne pincet werkzaam in de vorige stappen. Bundels van vezels kan voorzichtig worden weggetrokken, eerst van een, en vervolgens van de andere kant van het preparaat. De blootgestelde myenterische plexus kan niet los worden gezien van de longitudinale laag van spieren en de onderliggende serosa. Daarom, wat wordt genoemd de myenterische plexus voorbereiding is het segment dat kan worden gesneden langs de pinnen. Want het bevat live-spier, is het raadzaam om het pin zeer losjes in het schaaltje met zuurstof M199-DM tot het fysiologisch experiment begint.
7. Omdat het slijmvlies is het belangrijkste ENS sensor, en al de effectoren zijn ook verankerd in de darmwand, is het mogelijk om te ontleden semi-intact preparaten die hele reflex paden te behouden. Deze op maat gemaakte voorbereidingen vereisen combinaties van de beschreven stappen in 1.3. tot 1,6., toegepast op de aangrenzende gebieden van de geïsoleerde intestinale segment.
8. Een paar minuten voorafgaand aan de feitelijke optische experiment, de voorbereiding van de keuze is gemonteerd in de experimentele kamer, zorg ervoor dat de spanning gelijkmatig is verdeeld en het weefsel ligt helemaal plat tegen de Sylgard bodem. Dit wordt bereikt door het monster houden met meerdere zeer fijne pinnen die kan over de hele omtrek worden geplaatst zonder het toebrengen van weefselschade.

Deel 2: Voorbereiding van weefselmonsters voor optische recording

1. (Optioneel) Als achtergrond fluorescentie voorkomen kleurstof te binden aan resterende gladde spier-en bindweefsel, kunnen beide geïsoleerde plexus worden geïncubeerd gedurende 30-60 minuten in M199-DM met collagenase VII (≤ 50 U / ml) en protease-IX (≤ 0,5 ug / ml). Naar aanleiding van het enzym behandeling van de producten dienen te worden gewassen met, en in stand gehouden 's nachts in, M199-DM, vermeerderd met 10% dierlijk serum (bijv. paarden of runderen) en antibiotica (penicilline, 100U/ml, streptomycine, 100 ug / ml), in een kamer verzadigde wiste 95% O ₂ en 5% CO _2. Deze procedure, die we hebben gebruikt voor vele jaren, omdat het merkbaar verbetert de signaal-ruis verhouding van de optische opnames, mag niet nuttig zijn voor beginners en moeten worden goedgekeurd met de nodige voorzichtigheid. Inderdaad, een voorbereiding beschadigd tijdens dissectie loopt het risico van desintegratie tijdens het enzym behandeling. Echter, zelfs in de afwezigheid van het enzym behandeling, raden wij aan dat de voorbereidingen 's nachts worden gehandhaafd M199-DM met serum en antibiotica. Deze stap bevordert weefsel genezing na een acute dissectie schade, en verhoogt de transparantie van het monster.
2. Optische opnamen van elektrische activiteit kan niet worden bereikt in een preparaat waarin de spier krimpt. Daarom, om spiercontractie te voorkomen dat bij het opnemen van de myenterische plexus, een paar minuten voor de optische experiment hebben we 2 uM nifedipine toe te voegen aan de M199-DM baden het weefsel.

Deel 3: Kleuren met di-4-ANEPPDHQ

1. Di-4-ANEPPDHQ is commercieel verkrijgbaar in gevriesdroogde vorm. Wij raden het op te lossen in zuivere ethanol, het maken van een geconcentreerde stamoplossing [bv. 15-20 mg / ml]. Deze voorraad, indien bewaard bij -20 ° C, is zeer stabiel. Inderdaad, in ons laboratorium hebben we net klaar met de laatste druppel van een voorraad oplossing van deze kleurstof die we hadden bijna zes jaar geleden gemaakt.
2. De kleuroplossing moet worden opgesteld in M199-DM, en moet 2 uM nifedipine bevatten als het protocol vereist. De uiteindelijke concentratie van kleurstof kan zo laag zijn als 5 ug / ml en mag niet hoger zijn dan 50 ug / ml. Echter, afhankelijk van de concentratie van de voorraad, zal een bepaalde hoeveelheid ethanol aanwezig zijn in de kleuroplossing en dient rekening te worden gehouden. Bijvoorbeeld, een kleuroplossing met 50 ug / ml kleurstof ~ 0,3% ethanol bevatten, indien gemaakt van een 15 mg / ml bouillon, maar dicht bij 1% ethanol als de voorraad had een concentratie van slechts 5 mg / ml.
3. Voor het kleuren, is de voorbereiding onder water gedurende 10-30 minuten in de kleurstof oplossing. Na die periode, de kleurstof is weggespoeld en vervangen door vers, zuurstofrijk M199-DM. Aangezien de di-4-ANEPPDHQ is een membraan-impermeant kleurstof die fluoresceert alleen wanneer in een lipide-omgeving, moet een gezonde neuronen vanuit een gekleurd enterische voorbereiding hebben het uiterlijk van lege ballonnen.

Deel 4: Elektrische stimulatie

1. Stimulatie kan worden aangedreven door spanning of door de huidige. We maken gebruik van de huidige stimulatie, geleverd door een computer gestuurde, 4-kanaals stimulus generator met een maximum vermogen van 16 mA per kanaal.
2. De elektrode-model te gebruiken in een gegeven experiment wordt bepaald door de experimentele doelstelling. Intracellulaire pipetten of patch elektroden kan worden gebruikt wanneer het doel is het stimuleren van een bepaald neuron. Wanneer de stimulatie is bedoeld om meer dan een neuron te activeren in een bepaald ganglion, kan een extracellulair elektrode aanraken van een verbindende worden gebruikt. Aan elkaar te koppelen ganglia, grote, lage weerstand elektroden en / of multi-element elektrode arrays kunnen worden toegepast onderzoek, maar bij het gebruik van de huidige stimulatie als we over het algemeen doen, multi-element arrays worden de enige optie. Vele modellen van extracellulaire elektroden, evenals een aantal lineaire elektrode arrays, zijn verkrijgbaar bij commerciële bronnen.
3. Elektroden kunnen geplaatst worden met verschillende soorten micromanipulators. Om te voorkomen dat de trillingen veroorzaakt door de lange en fijne vaten, voor we met behulp van kleine micromanipulators op magnetische basen die kan worden geplaatst naast de experimentele kamer, en het ondersteunen van de flexibele vaten van de wolfraamelektroden met dunne, maar zeer stijf metalen staven.

Deel 5: Perfusie

We maken gebruik van een 2-kanaals peristaltische pomp met een kanaal voor de invoer van zuurstofrijk oplossingen, en de andere voor-uitgang. Aan mechanische storingen veroorzaakt door de perfusie te elimineren, de pomp wordt aangezet-off tijdens de overname van optische data.

Deel 6: Apparatuur voor meerdere locaties optische recording van de membraanpotentiaal

1. Optische componenten:
   
   Het apparaat voor meerdere locatie optische recording van membraanpotentiaal bestaat uit een NeuroCCD-SM camera (RedShirtImaging) en een 1:10 demagnifier / relais lens gemonteerd op de trinoculaire buis van een rechtop microscoop. De microscoop beweegt op een XY-vertaler, onafhankelijk van een fase die star is bevestigd aan de top van een actieve trillingsisolatie tafel. Te minimaliseren trillingen in de lucht, wordt het hele apparaat, omringd door zware akoestische gordijnen en een mylar dak. Epi-verlichting wordt verzorgd door een 100W wolfraam-halogeenlamp aangedreven door een ultra-low-rimpel feedback gestabiliseerde voeding. Het invallende licht is gemaakt quasi-monochromatische met behulp van een warmte filter, een high-Q interferentie filter (HQ530/50) en een 565 nm (50% transmissie) dichroic spiegel. Fluorescentie-emissie is gescheiden met behulp van de dichroïsche spiegel en een lange-pass filter (HQ572LP). Het intensiteit van het invallende licht wordt aangepast met neutrale dichtheid filters. Trans-verlichting, is voor bright-field bekijken van de voorbereiding door een seconde 100 W wolfraam-halogeenlamp aangedreven door een 0-55 V, 1-10 Een voeding die niet verplicht is om een ​​speciale attributen bezitten.
   
   
2. High-speed camera specificaties:
   
   De elektronische ontwerp en de prestatiekenmerken van de NeuroCCD-SM camera zijn beschreven in detail ^3. Kortom, het is een gekoeld, lage resolutie, precisie high-speed camera die de back-verdund gebruikt, back-verlichte Marconi CCD39-01 chip (80x80 pixels). Digitalisering is 14-bit, en de full frame rate is 2 kHz. Echter, voor specifieke doeleinden, kan een verhoging van de frame-rate tot een maximum van 10 kHz met behulp van diverse binning combinaties of vermindering van het aantal functionele pixels. De camera heeft het belangrijke voordeel van extreem lage ruis te lezen (23 elektronen op 2 kHz; 9 elektronen bij 1 kHz). Bovendien zijn pixels hebben een relatief grote, goed diepte (215.000 elektronen), waardoor een matige lichtintensiteit bij hoge frame rates.
   
   
3. Data Acquisition en analyse software:
   
   De optische experiment wordt gecontroleerd door Neuroplex, een software-pakket van RedShirtImaging, die werkt als een verzoek in de IDL-platform (Interactive Data Language) en bevat meerdere functies die nodig zijn voor acquisitie, weergave en analyse van de optische data.
   
   
4. Extra camera:
   
   Als een integraal onderdeel van het apparaat, een beam splitter op de trinoculaire hoofd van de microscoop relais een afbeelding van de voorbereiding op een tweede, met hoge resolutie CCD-camera is aangesloten op een frame-grabber. Het beeld, dat is overgenomen en opgeslagen met behulp van Global Image Lab / 2 software kunnen worden gesuperponeerd op de display van de sub-milliseconde tijdsopgeloste optische signalen gevangen genomen door de NeuroCCD-SM camera een nauwkeurige kaart van de ruimtelijke herkomst van de te genereren optisch opgenomen spanningssignalen. In ons lab, het frame grabber voor deze camera bevindt zich in een andere computer dan degene die verantwoordelijk voor het functionele data-acquisitie. Daarom is de image-bestand moet worden overgedragen van de ene computer naar de andere, en kleine aanpassingen in de grootte en positie van de afbeelding in hoge resolutie zijn vereist voordat perfecte registratie van de twee camera's wordt bereikt.

Deel 7: optische experimenten

1. Voorafgaand aan elke functionele opname, verkrijgen we de hoge-resolutie zwart-wit beeld van de regio waar we van plan om de elektrische activiteit opnemen door optische middelen (zoals aangegeven in 6.4). Dit beeld, toen bovenop op de pixel-kaart van de high-speed camera, helpt ons om identificeren van de structuren die de bron van de optische signalen.
2. In de juiste systeemconfiguratie, Neuroplex (zie 6.3) controleert ook de sluiter, en triggers van de elektrische stimulatie. Omdat de high-speed data acquisitie vereist aanzienlijke computer stroom, is het raadzaam, indien mogelijk, op een speciale computer met een grote hoeveelheid geheugen en een hoge capaciteit harde schijf. Dat is echter niet triviaal. Ons eigen systeem, bijvoorbeeld, al enkele jaren oud, telt data acquisitie kaarten die te groot zijn om te passen in state-of-the-art computers. Als een compromis, we aangenomen en gewijd aan onze optische systeem een ​​Dell Precision 390 uitgerust met een 500 GB harde schijf en 4 GB RAM-geheugen. Deze computer konden we houden onze oudere, maar toereikend, A / D en D / A-boards, terwijl nog zorgen voor voldoende kracht om onze experimenten uit te voeren.
3. Zodra de overname is voorbij is, kan Neuroplex geven de resultaten in meerdere complementaire formaten, waarvan sommige hieronder worden toegelicht:
   1. Een gedeelte van het scherm genaamd pagina toont de ruwe afbeelding van het preparaat zoals vastgelegd door de 80x80 high-speed camera als een individueel frame. Superpositie op deze pixel-kaart van de afbeelding in hoge resolutie verkregen met de tweede camera (zoals uitgelegd in 6.4 en 7.1) verfijnt de exploitant in staat is om interessegebieden te identificeren.
   2. Bij de pixels van deze pagina weer te geven zijn geselecteerd onder besturing van de muis, Neuroplex zet automatisch de optische uitgangen naar sporen die de omvang van de optische verandering geregistreerd door de pixels als een functie van de tijd laten zien. (Bv, AF / F versus tijd). De operator kan beslissen of deze sporen moet de output van de individuele pixels, of liever, de ruimte-gemiddelde output van meerdere loci over een bepaalde regio van het preparaat.
   3. De gegevens kunnen ook worden weergegeven in film-formaat.
      
      Om ervoor te zorgen dat alle informatie in de individuele experimentele draait volledig is uitgepakt, we echter voor off-line analyse van optische data. Representatieve resultaten van deze analyse zijn beschikbaar.

Deel 8: Hoe om de technische kwaliteit te bereiken in een optisch experiment

The technische succes van een optische experiment is gemeten, uiteindelijk, door de signaal-ruis verhouding van de opnames. Bovendien, een goede signaal-ruisverhouding stamt niet van een openbaring, maar van een reis. Net als in een opera, is het uiteindelijke resultaat bepaald door een veelheid van factoren die synergetisch op elkaar inwerken. Dus, te komen tot een technisch goed optisch experiment, is het essentieel om zelfstandig te verfijnen, de optische apparatuur en de vaardigheden die nodig zijn voor elke afzonderlijke stap van het protocol. Wat volgt is een lijst van potentiële problemen-gebieden en enkele suggesties voor het vermijden van problemen niet altijd te verwachten ^5:

1. Geluidsbronnen
   
   Mechanische en optische stabiliteit zijn van cruciaal belang bij het opnemen van elektrische activiteit met voltage-gevoelige kleurstoffen, omdat de fractionele wijzigen (AF / F) als gevolg van fysiologische reacties is relatief klein (<10% / 100 mV in de meeste van de darm opnamen) en een luidruchtige trace altijd voorteken is een slechte uitkomst. Daarom is het optimaliseren van de signaal-ruis-verhouding, is het noodzakelijk te elimineren, of ten minste, te minimaliseren, de bijdragen van de twee ergste overtreders: a) mechanische trillingen, en b) lichtbron fluctuatie.
   
   
   1. Mechanische trillingen worden gegenereerd door een verscheidenheid van bronnen zo divers als setup-configuratie, stabiliteit van een gebouw, nabijheid van gemotoriseerde apparatuur, lucht-stromingen, akoestische ruis, vloeiende bewegingen, of deeltjes zwevend in de baden oplossing. Een goede vibratie-isolatie-systeem, en akoestische gordijnen voor extreme gevallen (zie bijvoorbeeld beschrijving in 5.1), maken een groot verschil en zijn de moeite waard om de kosten ervan. Daarnaast, gezond verstand benaderingen, zoals filtratie van oplossingen gebruikt in het experiment, of het gebruik van magnetische bases voor kleine, beweegbare delen van de installatie, zijn zeer effectief.
   2. Lichtbronnen zijn het meest stabiel bij quasi-maximale intensiteit. Daarom moet een set een current-limiet voor de voeding, en, indien nodig, vermindering van de lichtintensiteit door het invoegen van neutrale dichtheid filters in het lichtpad in plaats van door het verminderen van de spanning. Booglampen zijn intrinsiek luidruchtig. Wolfraam-halogeen lampen of een light-emitting diodes zijn veel stabieler en moet de voorkeur ^6.
      
      
2. Dier leeftijd
   
   Dissecties moet worden gedaan met behulp van de darm van jonge dieren omdat, zoals het bindweefsel in de darm hardt met de leeftijd, wordt het moeilijker om individuele weefsel lagen te scheiden, zonder het toebrengen van ernstige schade aan de neuronen van de twee plexus, wiens afferente en efferente processen kruis layer grenzen en / of project al een afstand langs de lengteas van de darm. Dit advies, dat kan worden genegeerd bij het bestuderen van intra-ganglion verbindingen, is van het grootste belang bij de experimentele doel is de analyse van de inter-ganglion circuits of de activering van reflexen.
   
   
3. Dye internalisatie
   
   Het is belangrijk om een ​​zo laag kleurstof concentratie mogelijk, en om onnodige blootstelling aan licht te minimaliseren. Hoewel de di-4-ANEPPDHQ Het is gebleken dat veel minder fototoxische dan andere kleurstoffen, zal het je geïnternaliseerd, uiteindelijk, als de gezondheid van de voorbereiding verslechtert. Dye internalisatie vermindert de signaal-ruisverhouding door het verhogen dramatisch de achtergrond fluorescentie ^3.
   
   
4. Elektrode onderhoud
   
   
   1. Elektroden moeten zorgvuldig en grondig gewassen worden na elk experiment. Organische afzettingen op de toppen van wolfraamelektroden vergroten elektrode weerstand en het voorkomen van stimulatie.
   2. De isolatie van commercieel beschikbare wolfraam elektrode is zeer delicaat en gevoelig voor schade. Een lek in de isolatie zal shunt stroom, afbreuk doen aan de effectiviteit van de stimulatie en het welslagen van het experiment.
      
      
5. Perfusie gevaren
   
   Laat nooit de set-up zonder toezicht, terwijl de perfusie is ingeschakeld. Als de in-flow en out-flow van de peristaltische pomp niet goed uitgebalanceerd, kunnen twee katastrofisch evenementen plaats:
   1. Een overstroming kan leiden tot onomkeerbare schade aan de microscoop.
   2. Het preparaat kan uitdrogen tijdens het experiment.
      
      
6. Software gedoe
   
   Het is essentieel om zich vertrouwd te maken met de software die overname en door een analyse controles. Snelle data-acquisitie en / of de vorming van zeer grote bestanden hebben de neiging om het systeem te rijden naar de rand van defect, en Neuroplex, wat vrij onverzoenlijk, zal gestaag crash tenzij de randvoorwaarden in acht worden genomen. Subtiliteiten in de records, gemakkelijk gemist wanneer de analyse is beperkt tot de beperkte gebieden van belang, vaak openbaren zich in de film toont van de gegevens.

Discussion

Dit protocol is geschreven met twee doelpunten in het achterhoofd. De eerste is om andere onderzoekers ervan te overtuigen dat, dankzij de vele technologische vooruitgang van de laatste tien jaar, optische registratie van elektrische activiteit met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen is uitgegroeid tot een van de meest krachtige, betrouwbare en betaalbare methoden voor het bestuderen van intacte neuronale netwerken, ja , zou het zelfs eenvoudig worden geïmplementeerd in een laboratorium met bescheiden middelen. Het tweede doel is het bevorderen van het enterisch zenuwstelsel als een uniek experimenteel model waarin de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen correleren met de elektrische gedrag van de twee neuronale plexus en hun biologische uitgangen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	Sigma-Aldrich	M3769	With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate
Sylgard	Dow Corning	184 silicone elastomer kit
Insect pins used for dissection	F.S.T.	26001-30
Dumont forceps	F.S.T.	11203-23 or 11200-33
Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors	F.S.T.	15371-92
Pins to hold the tissue during the experiment	Seirin Corp.	Seirin Spinex
Collagenase VII	Sigma-Aldrich	C0773
Protease IX	Sigma-Aldrich	P6141
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10439-016
PenStrep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-Glutamine 100X	GIBCO, by Life Technologies	25030
Nifedipine	Sigma-Aldrich
Di-4-ANEPPDHQ	Molecular Probes, Life Technologies	D36802
4-Channel Stimulus Generator	Multi Channel System MCS GmbH	2000 Series
Peristaltic pump	Rainin	2-channel Dinamax RP-1
High-speed camera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
1:10 demagnifier / relay lens	Optem, Qioptiq Inc.
Upright microscope	Olympus Corporation	BX61TRF
Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator	Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada	PSSG--BX2
Linear matrix electrodes	FHC, Inc.	Custom made
Active vibration-isolation table	Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA	Micro 60
Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply	Kepco, Flushing, NY	ATE 75-15M
Heat filter	Schott AG	KG-1
High-Q interference filter	Chroma Inc.	HQ530/50
Dichroic mirror	Chroma Inc.	565 nm (50% transmission)
Long-pass filter	Chroma Inc.	HQ572LP
Acoustic curtains	Acoustical Surfaces, Inc.	BSC-25
Neuroplex	RedShirtImaging, LLC
IDL	ITT Visual Information Solutions
High-resolution CCD camera, with its own camera controller	Hamamatsu Corp.
Frame-grabber for high-resolution camera	Data Translation	DT3120K-1
Imaging software for high-resolution camera	Data Translation	Global Lab Image/2