Summary
Este protocolo se ilustra cómo los tintes sensibles al voltaje activar la grabación óptica de la actividad eléctrica de las redes neuronales intactos como los plexos de la cobaya sistema nervioso entérico, con una resolución ajustable que va desde una sola de las células ganglionares de varios circuitos.
Abstract
El sistema nervioso entérico (SNE) es una red independiente con funciones definidas, capaces de realizar conductas complejas de forma aislada. Sus neuronas (10 a 25 micras de diámetro) están dispuestas en plexos que se limitan a distintos planos de la pared intestinal
Protocol
Parte 1: preparación de tejidos
- Los preparativos del plexo submucoso y mientérico se encuentran aisladas por la disección secuencial desde el intestino delgado de 150-200g (2-3 semanas de edad) Hartley conejillos de indias que han sido anestesiados por inhalación de isoflurano y decapitado. Después de la eutanasia, el intestino delgado es extirpada y su contenido eliminado mediante el lavado de la luz con una solución caliente, oxigenada. Usamos Medio 199 suplementado con 25 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 y 2 mM de glutamina, y el pH ajustado a 7,4 (se refiere, a partir de ahora, como M199-DM), que ha sido previamente calentada a 37 ° C. Todo el resto de los pasos del protocolo, sin embargo, se llevará a cabo a temperatura ambiente.
- Un segmento intestinal, de 8-10 cm de longitud, se transfirió a una placa que contiene Sylgard M199-DM, se abrió a lo largo del borde mesentérico, y montado en la mucosa de arriba abajo, usando los pernos de los insectos. Es extremadamente importante para mantener una tensión uniforme, para que después fijando el tejido presenta una forma rectangular con las filas de la mucosa de las vellosidades regularmente alineados.
- Utilizando unas pinzas finas Dumont con puntas rectas, en una posición casi horizontal, es fácil de pelar la mucosa por el acaparamiento de las vellosidades en un extremo de la preparación y alejándose a lo largo del eje longitudinal del tejido. Cuando la muestra es uniforme fijado, las cintas de la mucosa puede ser separada en un unos pocos trazos individuales, la exposición de la submucosa que contiene los ganglios de la submucosa y la vascularización submucosa.
- Para la disección fina de los plexos, se recomienda utilizar un microscopio de disección con iluminación de campo oscuro. De hecho, el pseudo efecto tridimensional creado por este tipo de iluminación ayuda a distinguir las capas individuales, impidiendo o minimizando instrumento causado un daño.
- Para hacer una preparación de la submucosa, se sigue el procedimiento clásico de Hirst y McKirdy 4 que se requiere: a) hacer un corte en la capa submucosa siguiendo la orientación de las fibras musculares circulares, esto se puede lograr con unas tijeras muy finas (por ejemplo, una Moria MC19 o su equivalente), b) el levantamiento de la submucosa muy suavemente con las pinzas finas, mientras empuja la capa muscular circular hacia abajo con las tijeras finas, c) el corte a lo largo de los bordes longitudinales como la separación avanza para liberar a la submucosa del resto de la preparación, d) hacer un segundo corte siguiendo la orientación de las fibras musculares circulares a una distancia del primero, para definir el tamaño final de la preparación de la submucosa. El segmento resultante submucosa, que es sólo de 30 a 50 micras de espesor y tiene un aspecto tenue, se puede transferir a otro de los platos que contienen frescos Sylgard M199-DM, suavemente clavado y sin tensión, y se mantienen en una cámara de oxigenación para su uso posterior.
- El original del segmento intestinal, entonces privado de la mucosa y submucosa, y con el músculo circular expuesto, todavía se puede utilizar para producir un plexo mientérico preparación. Exponer el plexo mientérico, se debe eliminar en lo posible de la capa muscular circular. Esto se puede lograr mediante el uso de la misma recta de punta de unas pinzas finas empleados en los pasos anteriores. Haces de fibras se puede tirar suavemente lejos, primero de uno, y luego desde el otro lado de la preparación. La exposición plexo mientérico no puede ser separada de la capa muscular longitudinal y serosa subyacentes. Por lo tanto, lo que se llama plexo mientérico de preparación es el segmento que se puede cortar a lo largo de los pines. Debido a que contiene músculo vivo, se recomienda fijarlo de manera muy informal en el plato que contiene oxigenada M199-DM hasta que el experimento fisiológico comienza.
- Dado que la mucosa es el principal sensor ENS, y todos los efectores también están integrados en la pared del intestino, es posible dividir semi-intacta preparativos que conservan todo el reflejo de las vías. Estos preparados diseñados requerir combinaciones de los pasos descritos en 1.3. a 1.6., aplicado a las áreas adyacentes del segmento intestinal aislado.
- Unos minutos antes de la prueba real de óptica, la preparación de la elección se monta en la cámara experimental, asegurándose de que la tensión se distribuye uniformemente y el tejido queda completamente plana contra el fondo Sylgard. Esto se logra mediante la celebración de la muestra con múltiples alfileres muy finos que se pueden colocar en todo el perímetro sin causar daño a los tejidos.
Parte 2: Preparación de muestras de tejido para la grabación óptica
- (Opcional) Para evitar la fluorescencia de fondo de tinte de unión al músculo liso residual y el tejido conectivo, los plexos aislados pueden ser incubados durante 30-60 min en M199-DM que contiene colagenasa VII (≤ 50 U / ml) y la proteasa IX (≤ 0,5 mg / ml). Tras el tratamiento enzimático de los preparativos se deben lavar con, y mantener durante la noche en, M199-DM, más del 10% de suero de los animales (por ejemplo, equino o bovino) y antibióticos (penicilina, 100U/ml, estreptomicina, 100 mg / ml), en un cámara de saturación wi° 95% O 2 y el 5% de CO 2. Este procedimiento, que se ha utilizado durante muchos años, ya que mejora notablemente la relación señal-ruido de las grabaciones de óptica, no puede ser de ayuda para los principiantes y deben adoptarse con precaución. De hecho, una preparación dañadas durante la disección se corre el riesgo de desintegrarse durante el tratamiento enzimático. Sin embargo, incluso en ausencia del tratamiento enzimático, es recomendable que los preparativos se mantendrá durante la noche en M199-DM con suero y antibióticos. Este paso promueve la cicatrización de los tejidos después de un daño disección aguda, y aumenta la transparencia de la muestra.
- Grabaciones ópticas de la actividad eléctrica no se puede lograr en una preparación en la que el músculo se contrae. Por lo tanto, para prevenir la contracción de los músculos cuando se graba desde el plexo mientérico, unos minutos antes del experimento óptico que añadir 2 M de la nifedipina baño M199-DM del tejido.
Parte 3: La tinción con di-4-ANEPPDHQ
- Di-4-ANEPPDHQ está disponible comercialmente en forma liofilizada. Se recomienda su disolución en etanol puro, por lo que una solución madre concentrada [ml por ejemplo, 15-20 mg /]. Esta población, si se mantiene a -20 ° C, es muy estable. De hecho, en nuestro laboratorio, nos acaba de terminar la última gota de una solución stock de este medio de contraste que habíamos hecho hace casi 6 años.
- La solución de tinción debe estar preparado en M199-DM, y debe contener dos nifedipina M si el protocolo así lo requiere. La concentración final de medio de contraste puede ser tan baja como 5 mg / ml, y no debe ser superior a 50 mg / ml. Sin embargo, dependiendo de la concentración de la población, una cierta cantidad de etanol presente en la solución de tinción y se debe tomar en cuenta. Por ejemplo, una solución de tinción con 50 mg / ml de tintura se contienen etanol ~ 0,3% si se hace a partir de 15 mg / ml, pero el etanol cercana al 1% si la población tenía una concentración de tan sólo 5 mg / ml.
- Para la tinción, la preparación se sumerge durante 10-30 minutos en la solución de colorante. Después de ese período, el colorante se elimina por lavado y reemplazado por fresca y oxigenada M199-DM. Desde di-4-ANEPPDHQ es un colorante membrana impermeant que emite fluorescencia cuando en un ambiente de lípidos, las neuronas sanas a partir de una preparación entérica manchada debe tener el aspecto de globos vacíos.
Parte 4: La estimulación eléctrica
- La estimulación puede ser impulsado por la tensión o de corriente. Usamos la corriente de estimulación, entregado por un equipo controlado, de 4 canales generador de estímulos con una potencia máxima de 16 mA por canal.
- El modelo de electrodo que se utilizará en un experimento dado se determina por el objetivo experimental. Pipetas intracelular o electrodos de parche puede ser usado cuando el objetivo es la estimulación de una neurona en particular. Cuando la estimulación es la intención de activar más de una neurona en un ganglio determinado, un electrodo extracelular tocar un conectivo puede ser utilizado. Para el estudio de los ganglios de la interconexión, grandes electrodos de baja resistencia y / o de elementos múltiples conjuntos de electrodos se puede emplear, sin embargo, cuando se utiliza corriente de estimulación, como generalmente hacemos, conjuntos multielemento de ser la única opción. Muchos modelos de electrodos extracelulares, así como algunos conjuntos de electrodos lineal, están disponibles de fuentes comerciales.
- Los electrodos pueden ser colocados con diferentes tipos de micromanipulador. Para evitar la vibración inducida por cañones largos y finos, que favorecen el uso de micromanipuladores pequeño bases magnéticas que se puede colocar junto a la cámara experimental, y el apoyo a los barriles flexible de los electrodos de tungsteno con barras de metal delgado, pero muy rígido.
Parte 5: Perfusión
Usamos una bomba peristáltica de 2 canales con un canal para la entrada de soluciones oxigenada, y el otro para la salida. Para eliminar las perturbaciones mecánicas inducidas por la perfusión, la bomba está en funcionamiento durante la adquisición de datos ópticos.
Parte 6: Aparatos para el registro de sitios múltiples ópticas del potencial de membrana
- Componentes ópticos:
Los aparatos para el registro de sitios múltiples ópticas del potencial de membrana consta de una cámara NeuroCCD-SM (RedShirtImaging) y de 1:10 demagnifier / relé lente montada en el tubo trinocular de un microscopio vertical. El microscopio se mueve en un traductor XY, independientemente de una etapa que está fijado rígidamente a la cima de una tabla de aislamiento de vibración activa. Para minimizar las vibraciones en el aire, todo el aparato está rodeado de cortinas acústicas pesada y un techo de mylar. Epi-iluminación es proporcionada por una de 100W lámpara de tungsteno-halógeno alimentado por una fuente de energía muy bajo rizado retroalimentación estabilizado. La luz incidente se hace cuasi-monocromática utilizando un filtro de calor, un alto Q filtro de interferencia (HQ530/50) y 565 nm (50% de transmisión) espejo dicroico. Emisión de fluorescencia se separa con el espejo dicroico y un filtro de paso largo (HQ572LP). La intencióndad de la luz incidente se regula el uso de filtros de densidad neutra. Trans-iluminación, por brillante campo de visión de la preparación es proporcionado por un segundo de 100 W lámpara de tungsteno-halógeno impulsado por un V 0-55, 1-10 Una fuente de alimentación que no es necesario poseer los atributos especiales. - De alta velocidad especificaciones de la cámara:
El diseño electrónico y las características de funcionamiento de la cámara NeuroCCD-SM se han descrito en detalle 3. En pocas palabras, se trata de una resolución se enfrió, bajo, de alta precisión y velocidad de la cámara que utiliza el back-diluido, con iluminación posterior Marconi CCD39-01 chip (80x80 píxeles). La digitalización es de 14 bits, y la frecuencia de imagen máxima es de 2 kHz. Sin embargo, para fines específicos, se puede aumentar la velocidad de fotogramas de hasta un máximo de 10 kHz mediante el uso de diversas combinaciones de hurgar en la basura o la reducción del número de píxeles funcional. La cámara tiene la importante ventaja de ruido de lectura muy bajo (23 electrones en 2 kHz, 9 electrones a 1 kHz). Además, los píxeles que tienen una profundidad y relativamente grandes (215.000 electrones), permitiendo a intensidades moderadas de luz a velocidades de cuadro altas. - Adquisición de Datos y Análisis:
El experimento óptico es controlada por Neuroplex, un paquete de software de RedShirtImaging, que opera como una aplicación dentro de la plataforma IDL (Interactive Data Language) e incluye varias funciones necesarias para la adquisición, visualización y análisis de los datos ópticos. - Cámara adicional:
Como parte integral del aparato, un divisor de haz en la cabeza trinocular de los relés de microscopio una imagen de la preparación en un segundo, de alta resolución de la cámara CCD conectada a un marco de grabber. La imagen, que se adquiere y almacena utilizando Global Lab Image / 2 software, se pueden superponer en la pantalla de la sub-milisegundos de tiempo de resolver las señales ópticas captadas por la cámara NeuroCCD-SM para generar un mapa exacto del origen espacial de la ópticamente registrado señales de tensión. En nuestro laboratorio, la adquisición de imágenes de esta cámara se encuentra en un equipo diferente que el responsable de la adquisición de datos funcional. Por lo tanto, el archivo de imagen tiene que ser transferido desde un ordenador a otro, y pequeños ajustes en el tamaño y la posición de la imagen de alta resolución se requiere antes de un registro perfecto de las dos cámaras se logra.
Parte 7: Los experimentos de óptica
- Antes de cada grabación funcional, adquirir la imagen de alta resolución en blanco y negro de la región de la que tenemos la intención de registrar la actividad eléctrica por medios ópticos (como se indica en 6.4). Esta imagen, cuando se superponen en el mapa de píxeles de la cámara de alta velocidad, nos ayuda a identificar las estructuras que son la fuente de las señales ópticas.
- En la configuración del sistema apropiada, Neuroplex (ver 6.3) también controla el obturador, y provoca la estimulación eléctrica. Desde la adquisición de datos de alta velocidad requiere una considerable potencia de los ordenadores, se aconseja, si es posible, utilizar una computadora dedicada con una gran cantidad de memoria y un disco duro de alta capacidad. Que, sin embargo, no es trivial. Nuestro propio sistema, por ejemplo, ya tiene varios años, cuenta con placas de adquisición de datos que son demasiado grandes para caber en ordenadores de última generación. Como un compromiso, hemos adoptado y dedicado a nuestro sistema óptico de un Dell Precision 390 equipado con un disco duro de 500 GB y 4 GB de RAM. Este equipo nos permite mantener nuestros mayores, pero suficiente, A / D y D / A las juntas, sin dejar de ofrecer el poder suficiente para ejecutar los experimentos.
- Tan pronto como la adquisición es más, Neuroplex puede mostrar los resultados en múltiples formatos complementarios, algunos de los cuales se detallan a continuación:
- Un área de la pantalla de visualización de la página llamada muestra la imagen cruda de la preparación como se recoge en el 80X80 de alta velocidad de la cámara como un cuadro individual. Superposición en el mapa de píxeles de la imagen de alta resolución obtenida con la segunda cámara (como se explica en 6.4 y 7.1) afina la capacidad del operador s para identificar áreas de interés.
- Cuando los píxeles de la visualización de la página son seleccionados bajo el control del ratón, Neuroplex convierte automáticamente sus salidas ópticas en las huellas que muestran la magnitud del cambio de óptica registrados por los píxeles en función del tiempo. (Por ejemplo, Df / F frente al tiempo). El operador puede decidir si estos restos deben reflejar la salida de píxeles individuales, o, mejor dicho, la salida del espacio-un promedio de múltiples loci en una región determinada de la preparación.
- Los datos también se pueden mostrar en la película de formato.
Para asegurarse de que toda la información contenida en carreras experimentales individuo sea completamente extraído, sin embargo, estamos a favor de off-line de análisis de datos ópticos. Los resultados representativos de este análisis están disponibles.
Parte 8: ¿Cómo lograr la calidad técnica en un experimento óptico
ªéxito e técnica de un experimento óptico se mide, en última instancia, por la relación señal-ruido de las grabaciones. Además, una buena relación señal-ruido no proviene de una revelación, sino de un viaje. Al igual que en una representación de ópera, el resultado final es determinado por una multiplicidad de factores que interactúan sinérgicamente. Por lo tanto, para lograr un experimento óptico de vista técnico, es esencial para perfeccionar, de manera independiente, el aparato óptico y las habilidades requeridas para cada paso del protocolo. Lo que sigue es una lista de posibles áreas de problemas, y algunas sugerencias para evitar problemas no siempre esperado 5:
- Las fuentes de ruido
Estabilidad mecánica y óptica son cruciales cuando se graba la actividad eléctrica con tintes sensibles al voltaje, debido a que el cambio fraccional (Df / F), que refleja las respuestas fisiológicas son relativamente pequeñas (<10% / 100 mV en la mayoría de las grabaciones del intestino) y un seguimiento de ruido siempre augura un mal resultado. Por lo tanto, para optimizar la relación señal-ruido, es imprescindible para eliminar o, al menos, minimizar, las contribuciones de los dos peores: uno vibraciones) mecánico, y b) la fluctuación fuente de luz.- Vibraciones mecánicas son generados por una variedad de fuentes tan diversas como la configuración de la instalación, la construcción de la estabilidad, la proximidad de equipo motorizado, corrientes de aire, el ruido acústico, el movimiento del fluido, o partículas en suspensión en la solución del baño. Un buen sistema de aislamiento de vibraciones, y las cortinas acústicas para casos extremos (véase, por ejemplo, la descripción en el punto 5.1), hacer una gran diferencia y vale la pena el costo. Además, los enfoques de sentido común, tales como la filtración de las soluciones utilizadas en el experimento, o el uso de bases magnéticas para piezas pequeñas, móviles de la instalación, son bastante eficaces.
- Las fuentes de luz son más estables en casi máxima intensidad. Por lo tanto, se debe establecer un límite de corriente de la fuente de alimentación, y, cuando sea necesario, reducir la intensidad de la luz mediante la inserción de filtros de densidad neutra en la trayectoria de la luz en lugar de mediante la reducción de la tensión. Lámparas de arco son intrínsecamente ruidosa. Tungsteno-halógeno bombillas o diodos emisores de luz son mucho más estables y debe ser la opción preferida 6.
- Animal edad
Disecciones se debe realizar con el intestino de los animales jóvenes, ya que, como el tejido conectivo en el intestino se endurece con la edad, se hace más difícil separar las capas individuales de tejido sin causar grandes daños en las neuronas de los dos plexos, cuya aferentes y eferentes procesos pueden cruzar los límites de la capa y / o proyecto para una distancia considerable a lo largo del eje longitudinal del intestino. Este aviso, que puede no tenerse en cuenta cuando se estudian las conexiones intra-ganglionar, es de suma importancia cuando el objetivo es el análisis experimental de inter-ganglionares circuitos o la activación de vías de reflejos. - Internalización de tinte
Es importante usar como bajo una concentración de colorante como sea posible, y para minimizar la exposición de luz innecesaria. A pesar de di-4-ANEPPDHQ ha demostrado ser mucho menos fototóxico que otros tintes, se pondrá internalizado, con el tiempo, como la salud de la preparación se deteriora. Internalización colorante disminuye la relación señal-ruido, aumentando dramáticamente la fluorescencia de fondo 3. - Electrodo de mantenimiento
- Los electrodos deben ser lavados cuidadosamente y después de cada experimento. Depósitos orgánicos en las puntas de los electrodos de tungsteno aumentar la resistencia del electrodo y evitar la estimulación.
- El aislamiento de los electrodos de tungsteno disponibles en el mercado es muy delicado y propenso a sufrir daños. Una fuga en el aislamiento se shunt de corriente, poner en peligro la eficacia de la estimulación y poner en peligro el éxito del experimento.
- Peligros de perfusión
Nunca deje desatendida la puesta en marcha, mientras que la perfusión está encendida. Si el flujo en y fuera del flujo de la bomba peristáltica no están bien equilibradas, dos eventos catastróficos puede tener lugar:- Una inundación puede causar daños irreversibles en el microscopio.
- La preparación puede secarse durante el experimento.
- Molestias de software
Es esencial para familiarizarse con el software que controla la adquisición y análisis. Rápida adquisición de datos y / o la creación de archivos muy grandes tienden a manejar el sistema al borde del colapso, y Neuroplex, que es bastante implacable, se estrellará sin descanso a menos que sus condiciones de contorno son respetados. Sutilezas dentro de los registros, pasar desapercibidos cuando el análisis se limita a zonas limitadas de interés, a menudo se revelan en las pantallas de cine de los datos.
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Discussion
Este protocolo ha sido escrito con dos objetivos en mente. El primero es el de persuadir a otros investigadores que, gracias a los muchos avances tecnológicos de la última década, la grabación óptica de la actividad eléctrica usando tintes sensibles al voltaje se ha convertido en uno de los más poderosos, metodologías confiables y asequibles para el estudio de las redes neuronales intactos y, de hecho , podría ser fácilmente aplicado incluso en un laboratorio con recursos modestos. El segundo objetivo es promover el sistema nervioso entérico como un modelo experimental único para correlacionar los eventos moleculares y celulares con el comportamiento eléctrico de los dos plexos neuronales y sus productos biológicos.
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Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a DA Coulter (CHOP) por permitirnos usar sus dos fotones microscopio para adquirir las imágenes de 2 fotones que aparece al principio del video, y H. Takano por compartir con nosotros su experiencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
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- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
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- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
