Este protocolo ilustra como sensíveis à voltagem corantes permitir a gravação ótica da atividade elétrica de redes neurais intactos, como os plexos do cobaia sistema nervoso entérico, com uma resolução ajustável que varia de single-células ganglionares para multi-circuitos.
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Artigo de método
A gravação óptica de atividade elétrica na Guiné-porco Networks Enteric usando Tensão sensível Corantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede independente com funções identificadas, capaz de executar comportamentos complexos em isolamento. Seus neurônios (10 a 25 m de diâmetro) são arranjados em plexos que se limitam a planos distintos da parede do intestino
Protocolo
Parte 1: preparação do tecido
- Os preparativos submucoso e mioentérico do plexo são isolados por dissecção seqüencial a partir do intestino delgado de 150-200g (2-3 semanas de idade) Hartley porcos guinea que foram anestesiados por inalação de isoflurano e decapitado. Após a eutanásia, o intestino delgado é cortado e seu conteúdo removido por lavagem do lúmen com uma solução quente e oxigenado. Usamos Meio 199 suplementado com HEPES 25 mM, 5 mM NaHCO 3 e 2 mM de glutamina, e pH ajustado para 7,4 (referido, a partir de agora, como M199-DM), que foi pré-aquecido a 37 ° C. Todas as etapas restantes do protocolo, no entanto, serão realizadas à temper....
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Discussão
Este protocolo foi escrito com dois objetivos em mente. O primeiro é convencer outros investigadores que, graças aos avanços tecnológicos muitas da década passada, a gravação ótica da atividade elétrica utilizando corantes sensíveis à tensão tornou-se um dos mais poderosos, metodologias confiáveis e acessíveis para o estudo de redes neuronais intacta, na verdade , poderia ser facilmente implementado, mesmo em um laboratório com recursos modestos. O segundo objetivo é promover o sistema nervoso entérico como um modelo .......
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Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer DA Coulter (CHOP) por nos permitir usar seu microscópio dois-fotão para adquirir as imagens 2-fótons mostrada no início do vídeo, e H. Takano por compartilhar conosco seus conhecimentos técnicos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | Com sais de Earle’s, sem L-Glutamina, Fenol Vermelho e Bicarbonato de Sódio |
| Sylgard | Dow Corning | Kit de elastômero de silicone 184 | |
| Agulhas para insetos usadas na dissecação | F.S.T. | 26001-30 | |
| Pinça Dumont | F.S.T. | 11203-23 ou 11200-33 | |
| Tesoura de mola Moria MC19/B Pascheff-Wolff | F.S.T. | 15371-92 | |
| Agulhas para fixar o tecido durante o experimento | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Colagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Soro bovino fetal | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamina 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipina | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| Gerador de estímulo de 4 canais | Multi Channel System MCS GmbH | Série 2000 | |
| Bomba peristáltica | Rainin | Dinamax RP-1 de 2 canais | |
| Câmera de alta velocidade | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Desmagnificador 1:10 / lente de retransmissão | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Microscópio invertido | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Estágio fixo Gibraltar com tradutor motorizado X-Y | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canadá | PSSG--BX2 | |
| Eletrodos matriciais lineares | FHC, Inc. | Feitos sob encomenda | |
| Mesa com isolamento ativo de vibração | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Fonte de alimentação estabilizada com realimentação e baixa ondulação | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Filtro de calor | Schott AG | KG-1 | |
| Filtro de interferência de alta qualidade | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Espelho dicróico | Chroma Inc. | 565 nm (50% de transmissão) | |
| Filtro de passagem longa | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Cortinas acústicas | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| Câmera CCD de alta resolução, com seu próprio controlador de câmera | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber para câmera de alta resolução | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Software de imagem para câmera de alta resolução | Data Translation | Global Lab Image/2 |
Referências
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell....
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Reimpressões e permissões
