Summary
Este protocolo ilustra como sensíveis à voltagem corantes permitir a gravação ótica da atividade elétrica de redes neurais intactos, como os plexos do cobaia sistema nervoso entérico, com uma resolução ajustável que varia de single-células ganglionares para multi-circuitos.
Abstract
O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede independente com funções identificadas, capaz de executar comportamentos complexos em isolamento. Seus neurônios (10 a 25 m de diâmetro) são arranjados em plexos que se limitam a planos distintos da parede do intestino
Protocol
Parte 1: preparação do tecido
- Os preparativos submucoso e mioentérico do plexo são isolados por dissecção seqüencial a partir do intestino delgado de 150-200g (2-3 semanas de idade) Hartley porcos guinea que foram anestesiados por inalação de isoflurano e decapitado. Após a eutanásia, o intestino delgado é cortado e seu conteúdo removido por lavagem do lúmen com uma solução quente e oxigenado. Usamos Meio 199 suplementado com HEPES 25 mM, 5 mM NaHCO 3 e 2 mM de glutamina, e pH ajustado para 7,4 (referido, a partir de agora, como M199-DM), que foi pré-aquecido a 37 ° C. Todas as etapas restantes do protocolo, no entanto, serão realizadas à temperatura ambiente.
- Um segmento intestinal, 8-10 cm de comprimento, é transferido para um prato contendo Sylgard M199-DM, abriu ao longo da fronteira mesentérica, e montado mucosa lado-up utilizando os pinos de insetos. É extremamente importante manter a tensão, de modo que após a fixação do tecido apresenta uma forma rectangular com as linhas de vilosidades da mucosa regularmente alinhados.
- Utilizando uma pinça fina Dumont com pontas retas, numa posição quase horizontal, é fácil de descascar a mucosa, agarrando as vilosidades em uma extremidade da preparação e afastando-se ao longo do eixo longitudinal do tecido. Quando a amostra é uniformemente preso, fitas de mucosa podem ser separados em alguns cursos individuais, expondo a submucosa que contém os gânglios submucosos e da vasculatura submucosa.
- Para a dissecção fina dos plexos, recomendamos o uso de um microscópio de dissecação com iluminação de campo escuro. Na verdade, o efeito tridimensional pseudo criado por este tipo de iluminação ajuda a distinguir as camadas individuais, assim, prevenir ou minimizar danos infligidos instrumento.
- Para fazer uma preparação submucosa, seguimos o procedimento clássico de Hirst e McKirdy 4, que requer: a) fazer um corte na camada submucosa seguir a orientação das fibras musculares circular, o que pode ser conseguido usando uma tesoura muito fina (como um Moria MC19 ou seu equivalente); b) elevação da submucosa muito suavemente com a pinça fina, enquanto empurra a camada muscular circular para baixo, usando a tesoura fina; c) o corte longitudinal ao longo das bordas como a separação progride para libertar a submucosa do resto do prep; d) fazer um segundo corte seguindo a orientação das fibras musculares circular a uma distância do primeiro, para definir o tamanho final da preparação da submucosa. O segmento resultante da submucosa, que é apenas 30 a 50 mm de espessura e tem uma aparência gossamer, podem ser transferidos para um outro prato Sylgard contendo fresco M199-DM, gentilmente preso e sem tensão, e mantidos em uma câmara de oxigenada para uso posterior.
- O original do intestino segmento, agora privados de mucosa e submucosa, e com o músculo circular exposto, ainda pode ser usado para produzir uma preparação plexo mioentérico. Para expor o plexo mientérico, deve-se eliminar o máximo possível da camada muscular circular. Isto pode ser conseguido usando a mesma ponta reta fina fórceps empregados nas etapas anteriores. Feixes de fibras pode ser puxado para fora delicadamente, primeiro de um, e, em seguida, do outro lado da preparação. O exposto plexo mioentérico não pode ser separada da camada longitudinal de músculo ea serosa subjacente. Portanto, o que é chamado a preparação plexo mientérico é o segmento que pode ser cortada ao longo da pinos. Porque contém músculo vivo, é aconselhável fixá-lo de forma muito vaga no prato contendo oxigenados M199-DM até que a experimentação fisiológica começa.
- Uma vez que a mucosa é o sensor ENS principal, e todos os efetores são também incorporados na parede do intestino, é possível dissecar semi-intactas preparações que preservam todo vias reflexas. Estas preparações personalizados exigem combinações dos passos descritos no ponto 1.3. para 1,6., aplicada a áreas adjacentes do segmento isolado intestinal.
- Poucos minutos antes do experimento real óptica, a preparação de escolha é montado na câmara experimental, certificando-se que a tensão é distribuída uniformemente eo tecido fica completamente plana contra o fundo Sylgard. Isto é conseguido mantendo a amostra com múltiplos pinos muito fino que pode ser posicionada em todo o perímetro sem infligir danos aos tecidos.
Parte 2: Preparação de amostras de tecido para a gravação óptica
- (Opcional) Para evitar a fluorescência de fundo de corante ligação ao músculo liso residual e do tecido conjuntivo, tanto plexos isolados podem ser incubadas por 30-60 min em M199-DM contendo colagenase VII (≤ 50 U / ml) e Protease IX (≤ 0,5 mg / ml). Após o tratamento enzimático os preparativos devem ser lavadas com, e mantido durante a noite em, M199-DM, mais 10% de soro de animais (por exemplo, eqüino ou bovino) e antibióticos (penicilina, 100U/ml; estreptomicina, 100 mg / ml), em um câmara saturada wiº 95% O 2 e 5% CO 2. Este procedimento, que temos usado por muitos anos porque ele melhora visivelmente a relação sinal-ruído das gravações óptica, pode não ser útil para iniciantes e deve ser adotada com cautela. De fato, uma preparação danificados durante a dissecção corre o risco de se desintegrar durante o tratamento enzimático. No entanto, mesmo na ausência do tratamento enzimático, recomendamos que os preparativos ser mantida durante a noite em M199-DM com soro e antibióticos. Esta etapa promove a cura do tecido após a lesão dissecção aguda, e aumenta a transparência da amostra.
- Gravações ópticas de atividade elétrica não pode ser alcançada em uma preparação em que o músculo está se contraindo. Portanto, para evitar a contração muscular durante a gravação do plexo mioentérico, poucos minutos antes do experimento óptico que adicionar 2 nifedipina mM para o banho M199-DM do tecido.
Parte 3: A coloração com di-4-ANEPPDHQ
- Di-4-ANEPPDHQ está disponível comercialmente na forma liofilizada. Recomendamos dissolvendo-o em etanol puro, fazendo uma solução estoque concentrada [ml por exemplo, 15-20 mg /]. Este estoque, quando conservados a -20 ° C, é extremamente estável. De fato, em nosso laboratório, nós acabamos a última gota de uma solução estoque deste corante que tínhamos feito há quase 6 anos.
- A solução de coloração deve ser preparado em M199-DM, e deve conter duas nifedipina mM se o protocolo exige. A concentração final do corante pode ser tão baixos quanto 5 mg / ml e não deve ser superior a 50 mg / ml. No entanto, dependendo da concentração das ações, uma certa quantidade de etanol vai estar presente na solução de coloração e deve ser levado em conta. Por exemplo, uma solução de coloração com 50 mg / ml de corante conterá ~ 0,3% de etanol, se feita de um estoque 15 mg / ml, mas perto de 1% de etanol se o estoque tinha uma concentração de apenas 5 mg / ml.
- Para a coloração, a preparação está submerso por 10-30 minutos na solução corante. Após esse período, o corante é removido e substituído por fresco, oxigenado M199-DM. Desde di-4-ANEPPDHQ é um corante de membrana impermeant-que fluoresce apenas quando em um ambiente de lipídios, os neurônios saudáveis de uma preparação manchada entérico deve ter a aparência de balões vazios.
Parte 4: A estimulação elétrica
- Estímulo pode ser conduzido por tensão ou por corrente. Usamos a estimulação atual, entregue por um computador controlado, gerador de estímulo de 4 canais com uma potência máxima de 16 mA por canal.
- O modelo de eletrodo para ser utilizado em um experimento é determinado pelo objectivo experimental. Pipetas intracelular ou eletrodos patch pode ser usado quando o objetivo é a estimulação de um neurônio particular. Quando o estímulo se destina a ativar mais de um neurônio em um gânglio dado, um eletrodo extracelular tocar um conectivo pode ser usado. Para estudar gânglios interconexão, grande, de baixa resistência eletrodos e / ou multi-elemento de eletrodos podem ser empregadas, no entanto, quando se utiliza a estimulação atual como geralmente fazemos, multi-elemento arrays se tornam a única opção. Muitos modelos de eletrodos extracelular, bem como algumas matrizes de eletrodos linear, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais.
- Eletrodos podem ser posicionados usando diferentes tipos de micromanipuladores. Para evitar a vibração induzida por barris longos e finos, que defendem o uso micromanipuladores pequeno em bases magnético que pode ser posicionada adjacente à câmara experimental, e apoiar os barris flexível dos eletrodos de tungstênio com barras de metal fino, mas muito rígida.
Parte 5: Perfusão
Nós usamos um de 2 canais bomba peristáltica com um canal para a entrada de soluções oxigenado, e outra para saída. Para eliminar distúrbios mecânicos induzida pela perfusão, a bomba é ligada-off durante a aquisição de dados ópticos.
Parte 6: Aparelho para a gravação de vários sites óptica do potencial de membrana
- Componentes ópticos:
O aparelho para a gravação de vários sites óptica do potencial de membrana inclui uma câmera NeuroCCD-SM (RedShirtImaging) e uma lente demagnifier / relay 01:10 montado no tubo trinocular de um microscópio de pé. O microscópio se move sobre um tradutor XY, independentemente de um estágio que é rigidamente fixados no topo de uma tabela ativa vibração isolamento. Para minimizar a vibração no ar, todo o aparato é cercada por cortinas acústicas pesados e um telhado de mylar. Epi-iluminação é fornecida por uma lâmpada de tungsténio-100W alimentado por uma ultra-low-ripple da fonte de alimentação estabilizada comentários. A luz incidente é feita quase monocromática usando um filtro de calor, um alto-Q filtro de interferência (HQ530/50) e um 565 nm (50% de transmissão) espelho dicróico. Emissão de fluorescência é separado usando o espelho dicróico e um filtro passa-tempo (HQ572LP). A intensidade da luz incidente é ajustado através de filtros de densidade neutra. Trans-iluminação, para a brilhante campo de visão da preparação é fornecido por uma 100 W segunda lâmpada de tungsténio-impulsionada por um V 0-55, 1-10 A fonte de alimentação que não é necessário possuir quaisquer atributos especiais. - Alta velocidade especificações da câmera:
O projeto eletrônico e as características de desempenho da câmera NeuroCCD-SM têm sido descritos em detalhe 3. Resumidamente, é uma resolução, resfriado baixo, a precisão câmera de alta velocidade que usa o back-diluído, retro-iluminado Marconi chips CCD39-01 (80x80 pixels). Digitalização é de 14 bits, ea taxa de quadros total é de 2 kHz. No entanto, para fins específicos, pode-se aumentar o frame-rate, até um máximo de 10 kHz, usando combinações de várias binning ou reduzir o número de pixels funcional. A câmera tem a importante vantagem de extremamente baixo ruído de leitura (23 elétrons em 2 kHz; 9 elétrons em 1 kHz). Além disso, seus pixels têm uma profundidade relativamente grande assim (215.000 elétrons), permitindo intensidades de luz moderada a altas taxas de quadros. - Aquisição de Dados e Software Análise:
O experimento óptico é controlado por Neuroplex, um pacote de software de RedShirtImaging, que opera como um aplicativo na plataforma IDL (Interactive Data Language) e inclui vários recursos necessários para a exposição, aquisição e análise dos dados ópticos. - Camera adicionais:
Como parte integrante do aparelho, um divisor de feixe na cabeça trinocular dos relés microscópio uma imagem da preparação para um segundo, a câmera CCD de alta resolução ligado a um quadro grabber. A imagem, que é adquirido e armazenado usando global Lab software Image / 2, pode ser sobreposto sobre a tela do milissegundo sub-time-resolved sinais ópticos capturada pela câmera NeuroCCD-SM para gerar um mapa preciso da origem espacial da opticamente registrados sinais de tensão. Em nosso laboratório, o frame grabber para esta câmera reside em um computador diferente do que o responsável pela aquisição de dados funcionais. Portanto, o arquivo de imagem tem que ser transferidas de um computador para outro, e pequenos ajustes no tamanho e posição da imagem de alta resolução são necessários antes do registo perfeito das duas câmeras é alcançado.
Parte 7: experimentos Optical
- Antes de cada gravação funcional, nós adquirimos a imagem de alta resolução em preto e branco da região da qual pretende gravar a atividade elétrica por meios ópticos (como indicado em 6.4). Esta imagem, quando sobreposta sobre o pixel mapa da câmera de alta velocidade, nos ajuda a identificar as estruturas que são a fonte dos sinais ópticos.
- Na configuração do sistema adequado, Neuroplex (ver 6.3) também controla o obturador, e desencadeia a estimulação elétrica. Desde a alta velocidade de aquisição de dados exige considerável de alimentação do computador, é aconselhável, se possível, para usar um computador dedicado com uma grande quantidade de memória e um disco rígido de alta capacidade. Que, entretanto, não é trivial. Nosso próprio sistema, por exemplo, já há vários anos, emprega placas de aquisição de dados que são demasiado grandes para caber em state-of-the-art computadores. Como um compromisso, nós adotamos e dedicado ao nosso sistema óptico um Dell Precision 390 equipado com um drive de 500 GB e 4 GB de RAM. Esse computador permitiu-nos manter os nossos mais velhos, mas adequada, A / D e D / A placas, enquanto continua a fornecer energia suficiente para executar nossos experimentos.
- Assim que a aquisição é longo, Neuroplex pode exibir os resultados em vários formatos complementares, alguns dos quais são detalhadas a seguir:
- Uma área da tela chamado de exibição da página mostra a imagem crua da preparação como capturado pela câmera de alta velocidade 80x80 como um quadro individual. Superposição para este pixel mapa da imagem de alta resolução obtidas com a segunda câmera (como explicado em 6.4 e 7.1) refina a capacidade do operador s para identificar áreas de interesse.
- Quando pixels desta exibição da página são selecionados sob o controle do mouse, Neuroplex converte automaticamente os seus resultados ópticos em traços que mostram a magnitude da mudança óptico registrado por aqueles pixels em função do tempo. (Por exemplo, ΔF / F versus tempo). O operador pode decidir se esses traços devem refletir a saída de pixels individuais, ou melhor, a saída do espaço-média de locos múltiplos sobre uma dada região da preparação.
- Os dados também podem ser exibidos em formato de filme.
Para garantir que todas as informações contidas em corridas experimentais indivíduo é totalmente extraído, no entanto, nós somos a favor off-line análise de dados ópticos. Resultados representativos desta análise estão disponíveis.
Parte 8: Como alcançar a qualidade técnica em um experimento de óptica
Thsucesso técnico e de um experimento ótico é medida, em última instância, pelo sinal-ruído das gravações. Além disso, uma relação sinal-ruído bom não advém de uma epifania, mas a partir de uma viagem. Como em uma ópera, o resultado final é determinado por uma multiplicidade de fatores que interagem sinergicamente. Assim, para alcançar uma experiência de som tecnicamente óptico, é essencial para refinar, independentemente, do aparelho óptico e as competências necessárias para cada passo do protocolo. O que se segue é uma lista de potenciais problemas áreas, e algumas sugestões para evitar problemas nem sempre antecipado 5:
- Fontes de ruído
Estabilidade mecânica e ótica são cruciais quando gravar a atividade elétrica com voltagem-sensíveis corantes, porque a mudança fracionária (ΔF / F), refletindo respostas fisiológicas é relativamente pequena (<10% / 100 mV na maioria das gravações do intestino) e um traço sempre ruidosos augura um mau resultado. Portanto, para otimizar a relação sinal-ruído, torna-se imperativo para eliminar ou, pelo menos, minimizar, as contribuições dos dois piores: a vibrações) mecânico, e b) flutuação fonte de luz.- Vibrações mecânicas são gerados por uma variedade de fontes tão diversas como a instalação, configuração construção da estabilidade, a proximidade de equipamentos motorizados, correntes de ar, o ruído acústico, movimento fluido, ou partículas que flutuam na solução de banho. Um sistema de vibração isolamento bom, e cortinas acústicas para casos extremos (ver, por exemplo, a descrição em 5.1), fazer uma grande diferença e valem bem a pena o seu custo. Além disso, de senso comum abordagens, tais como filtração de soluções utilizadas no experimento, ou o uso de bases magnéticas para peças pequenas e móveis da instalação, são bastante eficazes.
- Fontes de luz são mais estáveis em quasi-máxima intensidade. Portanto, deve-se definir um limite de corrente para a fonte de alimentação, e, quando necessário, reduzir a intensidade da luz através da inserção de filtros de densidade neutra no caminho de luz em vez de reduzindo a tensão. Lâmpadas de arco são intrinsecamente ruidoso. Tungstênio-halogênio lâmpadas ou diodos emissores de luz são muito mais estáveis e devem ser a escolha preferida 6.
- Idade do animal
Dissecção deve ser feito usando o intestino de animais jovens, porque, como o tecido conjuntivo dentro do intestino endurece com a idade, torna-se mais difícil separar as camadas de tecidos sem causar grandes danos nos neurônios dos dois plexos, cujo aferentes e eferentes processos podem atravessam as fronteiras da camada e / ou projeto para uma boa distância ao longo do eixo longitudinal do intestino. Este comunicado, que pode ser desconsiderado quando se estuda intra-ganglionares conexões, é de suma importância quando o objetivo experimental é a análise de inter-ganglionares circuitos ou a ativação de vias reflexas. - Internalização Dye
É importante para usar como uma concentração baixa de corante possível, e para minimizar a exposição à luz desnecessária. Apesar de di-4-ANEPPDHQ provou ser muito menos do que outros corantes fototóxica, ele vai ficar internalizada, eventualmente, como a saúde da preparação deteriora. Internalização corante diminui a relação sinal-ruído, aumentando dramaticamente a fluorescência de fundo 3. - Manutenção eletrodo
- Eletrodos devem ser lavadas cuidadosamente e completamente após cada experimento. Depósitos orgânicos nas pontas dos eléctrodos de tungsténio aumentar a resistência do eletrodo e prevenir a estimulação.
- O isolamento do eletrodo de tungstênio disponível comercialmente é muito delicado e propenso a danos. Um vazamento no isolamento irá shunt atual, comprometer a eficácia da estimulação e comprometer o sucesso do experimento.
- Perigos de perfusão
Nunca deixe a autônoma set-up enquanto a perfusão está ligado. Se o fluxo de entrada e saída de fluxo da bomba peristáltica não são devidamente equilibrada, dois eventos catastróficos podem ocorrer:- Uma inundação pode causar danos irreversíveis ao microscópio.
- A preparação pode secar durante o experimento.
- Aborrecimentos Software
É essencial para familiarizar-se com o software que controla aquisição, bem como análise. Rápida aquisição de dados e / ou a criação de arquivos muito grandes tendem a conduzir o sistema à beira do colapso, e Neuroplex, que é bastante implacável, irá falhar a menos que incansavelmente suas condições de contorno são respeitados. Sutilezas dentro dos registros, passa facilmente despercebida quando a análise se limita a regiões limitadas de interesse, muitas vezes se revelam em telas de cinema dos dados.
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Discussion
Este protocolo foi escrito com dois objetivos em mente. O primeiro é convencer outros investigadores que, graças aos avanços tecnológicos muitas da década passada, a gravação ótica da atividade elétrica utilizando corantes sensíveis à tensão tornou-se um dos mais poderosos, metodologias confiáveis e acessíveis para o estudo de redes neuronais intacta, na verdade , poderia ser facilmente implementado, mesmo em um laboratório com recursos modestos. O segundo objetivo é promover o sistema nervoso entérico como um modelo único experimental em que a correlacionar eventos moleculares e celulares com o comportamento elétrico dos dois plexos neuronais e suas saídas biológica.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer DA Coulter (CHOP) por nos permitir usar seu microscópio dois-fotão para adquirir as imagens 2-fótons mostrada no início do vídeo, e H. Takano por compartilhar conosco seus conhecimentos técnicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M.
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
