Summary

Bone Preparazione Undecalcified per Istologia, Istomorfometria e analisi Fluorocromo

Published: January 08, 2010
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Summary

Istologia ossea Undecalcified fornisce importanti informazioni per una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. E 'tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento.

Abstract

Istologia ossea Undecalcified dimostra la micro-architettura del tessuto osseo. Esso mostra sia le componenti mineralizzata e cellulare di osso, che fornisce informazioni vitali sul turnover osseo o la formazione dell'osso ed il riassorbimento. Ciò ha enorme importanza in una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. Si produce belle immagini 1 e consente di tecniche quali la valutazione fluorocromo e istomorfometria 2. Analisi fluorocromo è una tecnica in cui vengono iniettati coloranti fluorescenti che si legano al calcio in un punto particolare momento, che permette di quantificare la quantità di mineralizzazione in quel dato momento. Istomorfometria è un processo di quantificazione delle ossa a livello microscopico.

Esecuzione di istologia undecalcified osso è tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Si richiede variazioni nella tecnica da quelli utilizzati in paraffina di serie incorporato istologia. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento. Preparazione dei campioni, fissazione e la lavorazione si ottengono con un modo simile a quello di altri tessuti molli, tuttavia a causa della densità e bassa permeabilità di osso molto più tempo di fissazione e tempi di lavorazione sono necessari, spesso prendendo diverse settimane. Incorporare si ottiene utilizzando un mezzo di supporto con durezza simili o uguali e la densità fino all'osso come metacrilato, ma a differenza di infiltrazione di paraffina e l'inclusione, questo è un passo irreversibile. Sezionamento può essere ottenuto dalla macinazione che produce una sezione più spessa, che è ottimale per gli studi, come l'analisi fluorocromo. Questo è meglio realizzato utilizzando una lama di diamante su un macrotome. In alternativa, sezioni più sottili possono essere prodotti per la microscopia ottica e questo si ottiene utilizzando un microtomo slitta con una lama molto affilata. Il microtomo slitta fornisce la solidità e la stabilità necessaria per grandi blocchi duri. Resina sezioni incorporato può essere colorato con una varietà di macchie, di cui sia dimostrato.

Protocol

Il tessuto è inserito in un contenitore sigillato contenente il 10% tampone fosfato soluzione di formalina 3. Garantire la minima esposizione alla luce, se l'analisi fluorocromo deve essere eseguita, in quanto il fluorocromi sono fotosensibili. Stabilire che l'orientamento del tessuto sarà richiesto. Tagliare il campione a misura, con l'orientamento corretto, utilizzando una sega a nastro. Adottare misure di sicurezza sono rispettate. Il campione viene poi inserito in un contenitore opaco, i…

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare per l'aiuto della signora Sue Connell per la sua esperienza in embedding resina e la sig.ra Stefania Tombe per la sua esperienza di laboratorio. Gli autori desiderano ringraziare il professor Frank e il dottor Kandziora Marie-Anne Polboth per i loro consigli.

Materials

Solvents:
  • 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
    All histology grade, sulfur free.
    Grale Scientific Pty Ltd.
    http://www.grale.com.au
Moulds:
  • Peel away, plastic moulds
    Grale Scientific
Slides: Resin: Stains
(Reagents from Grale Scientific)

Goldner’s Trichrome stain

1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)

a) Hemotoxylin solution
Hemotoxylin1g
Absolute Alcohol100mL
b) Iron Solution
30% aqueous ferric chloride4mL
Hydrochloric acid (concentrated)1mL
distilled Water95mL

Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.

2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions

a) Ponceau de xylidine solution
Ponceau de xylidine0.75g
acid fuchsion0.25g
Acetic Acid1mL
mix, and add distilled water (100mL)
b) azophloxin solution
Azophloxin0.5g
Acetic acid0.6mL
mix, and add distilled water (100mL)
c) Final working stain solution
Ponceau-fuchsin solution5-10mL
Azophloxin2mL
0.2% acetic acid solution88mL

3. Light Green Solution

Light Green1g
acetic acid1mL
Mix, and add distilled water (500mL)

4. Phophomolybdic acid-Orange G solution

Phosphomolybdic acid3g
Orange G2g
Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol.

Von Kossa Stain

1% aqueous silver nitrate
2.5% sodium thiosulfate
1% safranin O

Alcian blue stain

Alcian blue 8GX1g
3% acetic acid solution100mL

Hemotoxylin and Eosin stain

a)Harris’s hemotoxylin
Hemotoxylin2.5g
Absolute alcohol25mL
Potassium Alum50g
distilled water500mL
mercuric oxide1.25g OR
Sodium iodate0.5g
Glacial acetic acid20mL
b) Eosin solution
Commercially produced Eosin was used.

All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents

Fluorochromes


Manufacturer
Fluorochrome Catalogue Number
Sigma-Aldrich, Sydney Calcein Green C0875
Sigma-Aldrich, Sydney Alizarin Complexone A3882
Intervet Australia, Victoria Oxytetracycline
(off the shelf antimicrobial drug)
Tradename; Engemycin 100

References

  1. Kerr, J. . Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).
  2. Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
  3. An, Y. H., Martin, K. l. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).
  4. Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).

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Cite This Article
Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis. J. Vis. Exp. (35), e1707, doi:10.3791/1707 (2010).

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