Bone Preparazione Undecalcified per Istologia, Istomorfometria e analisi Fluorocromo
Summary
Istologia ossea Undecalcified fornisce importanti informazioni per una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. E 'tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento.
Abstract
Istologia ossea Undecalcified dimostra la micro-architettura del tessuto osseo. Esso mostra sia le componenti mineralizzata e cellulare di osso, che fornisce informazioni vitali sul turnover osseo o la formazione dell'osso ed il riassorbimento. Ciò ha enorme importanza in una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. Si produce belle immagini 1 e consente di tecniche quali la valutazione fluorocromo e istomorfometria 2. Analisi fluorocromo è una tecnica in cui vengono iniettati coloranti fluorescenti che si legano al calcio in un punto particolare momento, che permette di quantificare la quantità di mineralizzazione in quel dato momento. Istomorfometria è un processo di quantificazione delle ossa a livello microscopico.
Esecuzione di istologia undecalcified osso è tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Si richiede variazioni nella tecnica da quelli utilizzati in paraffina di serie incorporato istologia. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento. Preparazione dei campioni, fissazione e la lavorazione si ottengono con un modo simile a quello di altri tessuti molli, tuttavia a causa della densità e bassa permeabilità di osso molto più tempo di fissazione e tempi di lavorazione sono necessari, spesso prendendo diverse settimane. Incorporare si ottiene utilizzando un mezzo di supporto con durezza simili o uguali e la densità fino all'osso come metacrilato, ma a differenza di infiltrazione di paraffina e l'inclusione, questo è un passo irreversibile. Sezionamento può essere ottenuto dalla macinazione che produce una sezione più spessa, che è ottimale per gli studi, come l'analisi fluorocromo. Questo è meglio realizzato utilizzando una lama di diamante su un macrotome. In alternativa, sezioni più sottili possono essere prodotti per la microscopia ottica e questo si ottiene utilizzando un microtomo slitta con una lama molto affilata. Il microtomo slitta fornisce la solidità e la stabilità necessaria per grandi blocchi duri. Resina sezioni incorporato può essere colorato con una varietà di macchie, di cui sia dimostrato.
Protocol
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare per l'aiuto della signora Sue Connell per la sua esperienza in embedding resina e la sig.ra Stefania Tombe per la sua esperienza di laboratorio. Gli autori desiderano ringraziare il professor Frank e il dottor Kandziora Marie-Anne Polboth per i loro consigli.
Materials
- 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
All histology grade, sulfur free.
Grale Scientific Pty Ltd.
http://www.grale.com.au
- Peel away, plastic moulds
Grale Scientific
- SUPERFROST PLUS Microscope slides
Lomb Scientific Pty Ltd.
http://www.lomb.com.au
- GlycolMethacrylate Technovit 7100
Heraeus Kulzer
http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm - Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
Heraeus Kulzer
(Reagents from Grale Scientific)
Goldner’s Trichrome stain
1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)
| a) Hemotoxylin solution | |
| Hemotoxylin | 1g |
| Absolute Alcohol | 100mL |
| b) Iron Solution | |
| 30% aqueous ferric chloride | 4mL |
| Hydrochloric acid (concentrated) | 1mL |
| distilled Water | 95mL |
Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.
2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions
| a) Ponceau de xylidine solution | |
| Ponceau de xylidine | 0.75g |
| acid fuchsion | 0.25g |
| Acetic Acid | 1mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| b) azophloxin solution | |
| Azophloxin | 0.5g |
| Acetic acid | 0.6mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| c) Final working stain solution | |
| Ponceau-fuchsin solution | 5-10mL |
| Azophloxin | 2mL |
| 0.2% acetic acid solution | 88mL |
3. Light Green Solution
| Light Green | 1g |
| acetic acid | 1mL |
| Mix, and add distilled water (500mL) | |
4. Phophomolybdic acid-Orange G solution
| Phosphomolybdic acid | 3g |
| Orange G | 2g |
| Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol. | |
Von Kossa Stain
| 1% aqueous silver nitrate |
| 2.5% sodium thiosulfate |
| 1% safranin O |
Alcian blue stain
| Alcian blue 8GX | 1g |
| 3% acetic acid solution | 100mL |
Hemotoxylin and Eosin stain
| a)Harris’s hemotoxylin | |
| Hemotoxylin | 2.5g |
| Absolute alcohol | 25mL |
| Potassium Alum | 50g |
| distilled water | 500mL |
| mercuric oxide | 1.25g OR |
| Sodium iodate | 0.5g |
| Glacial acetic acid | 20mL |
| b) Eosin solution | |
| Commercially produced Eosin was used. | |
All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents
Fluorochromes
Manufacturer |
Fluorochrome | Catalogue Number |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Calcein Green | C0875 |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarin Complexone | A3882 |
| Intervet Australia, Victoria | Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug) |
Tradename; Engemycin 100 |
References
- Kerr, J. . Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
- An, Y. H., Martin, K. l. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).
