Preparação óssea Undecalcified de Histologia, Histomorfometria e Análise Fluorocromo

Summary

Histologia óssea Undecalcified fornece informações importantes para uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. É tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los.

Abstract

Histologia óssea Undecalcified demonstra a micro-arquitetura do osso. Ele mostra tanto os componentes mineralizados e celulares do osso, que fornece informações vitais sobre o turnover ósseo ou formação e reabsorção óssea. Isto tem uma enorme importância em uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. Ele produz belas imagens ¹ e permite técnicas como a avaliação fluorocromo e histomorfometria ^2. Análise fluorocromo é uma técnica onde corantes fluorescentes que se ligam ao cálcio são injetados em um ponto determinado momento, que permite a quantificação da quantidade de mineralização naquele momento. Histomorfometria é um processo de quantificação do osso ao nível microscópico.

Realizar histologia óssea undecalcified é tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Ela exige variações na técnica dos utilizados em parafina padrão incorporado histologia. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los. Preparação de amostras de fixação e processamento são alcançados com uma forma semelhante a outros tecidos moles, no entanto, devido à densidade e menor permeabilidade do osso consideravelmente maior fixação e os tempos de processamento são necessárias, muitas vezes levando várias semanas. Incorporação é alcançado usando um meio de suporte com dureza semelhantes ou iguais e densidade do osso, como metacrilato de resinas à base, mas ao contrário de infiltração de parafina e incorporação, este é um passo irreversível. Seccionamento pode ser conseguido através de moagem, que produz uma espessa seção, que é ótimo para os estudos, como a análise fluorocromo. Este é o melhor conseguido usando uma lâmina de diamante em uma macrotome. Alternativamente, as seções mais finas podem ser produzidas por microscopia de luz e isso é conseguido usando um micrótomo trenó com uma lâmina muito afiada. O micrótomo sledge fornece a maior resistência e estabilidade necessária para grandes blocos rígidos. Seções de resina incorporado pode ser manchado com uma variedade de manchas, que são demonstradas.

Protocol

O tecido é colocado em um recipiente selado contendo fosfato tamponado a 10% solução de formalina 3. Garantir que a exposição mínima à luz, se a análise fluorocromo é para ser realizado, como a fluorocromos são sensíveis à luz. Estabelecer qual a orientação do tecido serão necessários. Apare a amostra com o tamanho, na orientação correta, usando uma serra de fita. Medidas de garantir a segurança são cumpridas. A amostra é então colocada em um recipiente opaco, cujo volume deve ser de…

Materials

Solvents:

• 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
  All histology grade, sulfur free.
  Grale Scientific Pty Ltd.
  http://www.grale.com.au

Moulds:

• Peel away, plastic moulds
  Grale Scientific

Slides:

• SUPERFROST PLUS Microscope slides
  Lomb Scientific Pty Ltd.
  http://www.lomb.com.au

Resin:

• GlycolMethacrylate Technovit 7100
  Heraeus Kulzer
  http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm
• Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
  Heraeus Kulzer

Stains
(Reagents from Grale Scientific)

Goldner’s Trichrome stain

1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)

a) Hemotoxylin solution
Hemotoxylin	1g
Absolute Alcohol	100mL
b) Iron Solution
30% aqueous ferric chloride	4mL
Hydrochloric acid (concentrated)	1mL
distilled Water	95mL

Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.

2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions

a) Ponceau de xylidine solution
Ponceau de xylidine	0.75g
acid fuchsion	0.25g
Acetic Acid	1mL
mix, and add distilled water (100mL)
b) azophloxin solution
Azophloxin	0.5g
Acetic acid	0.6mL
mix, and add distilled water (100mL)
c) Final working stain solution
Ponceau-fuchsin solution	5-10mL
Azophloxin	2mL
0.2% acetic acid solution	88mL

3. Light Green Solution

Light Green	1g
acetic acid	1mL
Mix, and add distilled water (500mL)

4. Phophomolybdic acid-Orange G solution

Phosphomolybdic acid	3g
Orange G	2g
Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol.

Von Kossa Stain

1% aqueous silver nitrate

2.5% sodium thiosulfate

1% safranin O

Alcian blue stain

Alcian blue 8GX	1g
3% acetic acid solution	100mL

Hemotoxylin and Eosin stain

a)Harris’s hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
Absolute alcohol	25mL
Potassium Alum	50g
distilled water	500mL
mercuric oxide	1.25g OR
Sodium iodate	0.5g
Glacial acetic acid	20mL
b) Eosin solution
Commercially produced Eosin was used.

All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents

Fluorochromes

Manufacturer	Fluorochrome	Catalogue Number
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcein Green	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarin Complexone	A3882
Intervet Australia, Victoria	Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug)	Tradename; Engemycin 100