Summary
Elektrofysiologiska svar luktsinnet sensoriska nervceller som doftämnen kan mätas på insekter använder en sensillum inspelningar. I den här videon artikel kommer vi att visa hur man utför enstaka sensillum inspelningar i antennerna av vinäger flyga (
Abstract
Luktsinnet är viktigt för insekter att hitta mat, kompisar, rovdjur och webbplatser äggläggning 3. Insect lukt sensoriska neuron (OSN) är inneslutna i sensoriska hårstrån som kallas sensilla, som täcker ytan av luktsinnet organ. Ytan på varje sensillum är täckt med små porer, genom vilka doftämnen passerar och lös i en vätska som kallas sensillum lymfa, som badar sensoriska dendriter av OSN inrymt i en given sensillum. Den OSN dendriter uttrycka luktreceptor (OR) proteiner, som i insekter fungera som lukt-jonkanaler 4, 5. Samspelet mellan odörer med yttersta randområdenas antingen ökar eller minskar den basala eldhastighet av OSN. Denna nervaktivitet i form av aktionspotentialen förkroppsligar den första representationen av kvalitet, intensitet och tidsmässiga egenskaper luktämnen 6, 7.
Med tanke på den lätt tillgång till dessa sensoriska hårstrån, är det möjligt att utföra extracellulära inspelningar från enstaka OSN genom att införa en inspelning elektroden i sensillum lymfan, medan referensvärdet elektroden placeras i lymfan i ögat eller kroppen av insekter. I Drosophila, sensilla hus mellan en och fyra OSN, men varje OSN visar vanligtvis en karakteristisk spik amplitud. Spike sortering teknik gör det möjligt att tilldela tillsatta svar på enskilda OSN. Denna enda sensillum inspelning (SSR) teknik övervakar skillnaden i potential mellan sensillum lymfan och referenselektrod som elektrisk spikes som genereras av receptorn aktivitet på OSN 1, 2, 8. Förändringar i antalet spikar som svar på luktämnen representera cellulära grund av lukt kodning i insekter. Här beskriver vi förberedelserna metod som för närvarande används i vårt laboratorium för att utföra SSR på Drosophila melanogaster och Anopheles gambiae, och visa representativa spår orsakade av doftämnen i en sensillum-specifika sätt.
Protocol
1. Lukt spädningar
- De flesta odörer är lösliga i paraffinolja. Däremot kan DMSO och etanol även användas som alternativ lösningsmedel för vissa lukter. Förbereda lämpliga spädningar (t.ex. 1:10 volym: volym, v: v) från rena doftämnen i injektionsflaskor av glas. De flesta lukt spädningar är stabila vid rumstemperatur, men för mycket flyktiga ämnen är det bättre att göra arbetet spädningar på veckobasis. Varje sensillum svarar på olika dofter i olika koncentrationsintervall. För Drosophila, en bra look-up tabell för lämpliga koncentrationer att använda med en viss sensillum finns i 6, 7.
För video-experimentet använder vi paraffinolja som lösningsmedel kontroll och metylacetat (10 -6 V: V i paraffinolja) och 1-okten-3-ol (10 -7 V: V i paraffinolja) för Drosophila och Anopheles inspelningar, respektive. - Med sax, klippa av kromatografi papper i 3 mm x 5 cm remsor så att de passar in Pasteur pipetter.
- Pipettera 30 mikroliter av önskad lukt på ett filterpapper band och sätt in den i glaspipett. Klipp ~ 3 cm luftslang och sätt in det i den öppna änden av pipetten, stänga den med en kontakt. Kontakten används för att försegla pipetten som ska bifogas sedan till luft-line-rör av en luftpump när det är dags att leverera lukt under experimentet.
2. Lukt leveranssystem
- Använd en liten borr, skär ett 10 mL plast serologisk pipett (t.ex. vid 4 ml-strecket) och skapa två hål (t.ex. vid -1,5 ml och -0,5 ml märken) som kommer att användas för att hålla pipetterna innehåller lukter. Sätt en 200 mikroliter pipettspets i taggar kopplingen och införa kopplingen till den trubbiga änden av 10 ml pipett. Pipetten kommer att användas som en del av leveransen för doftämnen.
- Fäst pipetten på ett magnetiskt stativ med en pipett klämma och placera den i närheten av mikroskop.
3. Skärpning elektroder
- Att vässa elektroder, förbereda en 0,5 M lösning av kaliumhydroxid (KOH) och filtrera den för att ta bort fina partiklar (t.ex. med en 45 ìm filter). Ta en 20 ml spruta och göra ett litet hål (~ 2 mm i diameter) med hjälp av en nål på väggen nära spetsen (~ 1 cm från spetsen), i vilken den elektriska kabeln är isatt (Figur 1A).
- Fyll sprutan med 0,5 M KOH, och kläm fast den på ett stativ under mikroskop, så att spetsen är placerad i synfältet (Figur 1B, C). Sätt in den elektriska kabeln i det lilla hålet på sprutan väggen (Figur 1B) och se till att kabeln inte är direkt framför ingången till sprutan. Anslut denna kabel till katoden av en DC strömförsörjning (t.ex. Wild Heerbrugg MTR32, se metoder) eller en pol växelström (t.ex. Wild Heerbrugg-LEP 990.018). Fäst axeln elektroden hållaren på den manuella mikromanipulator på höger sida av mikroskop, och bifoga en elkabel vid basen av elektroden innehavaren axeln med en krokodilklämma. Anslut kabeln till anoden av DC strömförsörjning eller den andra polen av AC strömförsörjning (Figur 1A).
- Sätt i volfram tråd (~ 5 cm långa) i elektrodhållaren, och bifoga det till elektroden innehavaren axeln på roboten. Ställ in strömförsörjningen till 6 V, och in spetsen av kabeln i sprutan upprepade gånger för att finslipa det, var noga med att övervaka spetsen under mikroskop under processen (Figur 1C). För att få en perfekt elektrod för inspelning, placera 90% av sin längd i lösningen i upp till 1 min, och dra ut den långsamt. Sätt sedan bara ~ 50% av elektroden för att ytterligare tunna i 30 s, och upprepa den för att få toppen av tråd vässade (~ 10 gånger).
Spetsen på elektroden ska vara bra nog att gå in i sensillum, men inte så fint som att böja när den berör det under inspelningarna (steg 6 och 7). Även titta på elektrodspetsen under dissekera mikroskop medan den slipas är en bra indikation på dess tjocklek, bara titta på det under inspelningen mikroskop med hög förstoring ger en tydlig uppfattning om en viss elektrod är lämplig för inspelning.
4. Insect prep: Drosophila antenn
- Bygg en fluga aspirator. Klipp en bit luftslang tillräckligt länge för att hänga runt halsen (ca 90 - 120 cm). Skär av toppen på en 200 mikroliter pipettspets och infoga den i ena änden av röret. På den andra änden, placera en ~ 1,5 cm x 1,5 cm bit av mesh så att den skapar en fysisk barriär, men inte hindrar luften från att strömma ut ur röret. Skär av toppen på en 1 mL pipettspets och placera den bredare änden på toppen av röret öppnas, blockera maska i mellan. Denna del kommer att användas för att plocka upp och manipulera vuxna vinäger flugor (Figur 2).
- Ta ett objektglas och lägg en bit dentalvax ungefär i mitten av långsidan. Ovanpå det positiona skyddsglas något lutande uppåt (~ 30) och se till att vaxet inte är direkt under den översta delen, som skulle förhindra visualisering av vinäger flyga under mikroskop. Dra en glaselektrod med vertikala avdragare. Spetsen bör vara tunn och flexibel nog att passa in mellan andra och tredje antennal segmentet, och hålla antennen stabilt för inspelningar. Placera glaselektrod på en annan bit vax och placera den på sidan av skyddsglas, tillräckligt långt att när spetsen sänks den når hörnet på täckglaset (Figur 3A).
- Arbeta från en flaska av vuxna flugor av den önskade genotyp, plocka upp en vuxen vinäger fluga med fluga aspirator. Även honor brukar användas på grund av sin större storlek, kan män också användas. Placera en 200 mikroliter pipettspets ovanpå 1 ml tips för att undvika att flyga från att fly. Blåsa i röret, så att flugan trycks mot slutet av 200 mikroliter pipettspetsen. Trimma den breda änden av pipettspetsen med rakbladet några millimeter ifrån flyga själv, sedan in lite vax för att förhindra att flyga från uppbackning ut. Under ett mikroskop, skära igen nära huvudet av vinäger flyga, uppmärksamma att inte skada djuret. Med en liten pipett spets, tryck vaxet att tvinga flyga iväg så att ungefär hälften av ögonen pressa från spets (Figur 3B). Se till att benen inte kommer så bra, eller de kan gå och störa inspelningarna.
- Montera flyga på en bit vax, huvudet uppåt, och placera den på bilden framför skyddsglas. Skjut huvudet något mot hörnet av glaset, så att antennerna utvidga och vilar på glaset. Sänk spetsen av glaset kapillära mellan andra och tredje antennal segment (Figur 3B).
- Olika delar av antennen kommer att ge tillgång till olika sensilla typer. Beroende på särskilda experimentella behov kommer antennen måste vara inriktade på olika sätt för att ge tillgång till olika sensilla typer. För att spela in från stora basiconic sensilla som i vårt exempel är Arista trycks ner på glaset (Figur 3B).
5. Insect prep: Anopheles maxillary palps
- Använda en elektrisk aspirator (Figur 2E), samla 40 till 60 3-5 dagar gamla myggor (blandat män och kvinnor) i den lilla plast bur (Figur 2F). Myggor borde ha fötts upp under normala förhållanden, dvs i en insekt inkubator eller insectary vid 25-28 ° C och 70-80% luftfuktighet. Placera små plast bur med djuren på is för ~ 15 min tills de är sövda av kyla. När djuren har slutat röra sig, överföring endast 4-6 djur på scenen under lupp vid någon tidpunkt, att hålla resten av djuren på is under förfarandena. Även honor brukar användas på grund av deras känslighet för CO 2, kan män också användas. Välj kvinnliga eller manliga myggor, att döma av strukturen i deras antenn (fjäder-liknande hos kvinnor, glödtråden-liknande hos män), och ta bort sina vingar och ben med fin pincett för att immobilisera dem. Förvara dem i en liten plastmugg med ett vått papper i botten, att hindra dem från uttorkande.
- Lägg två bitar av dubbelhäftande tejp (~ 1 cm långa) parallellt med varandra (~ 1 cm från varandra), i centrum och vid sidan av bilden glas (figur 3C). Med fin pincett, placera en mygga på det centrala bandet under dissekera mikroskop, och vrid den åt sidan och hålla sin kropp och ett öga på bandet. Justera positionen av att käk palps så att både palps förlänga parallellt på bandet (Figur 3D). Fäst maxillary palps genom att placera tunna strängar (t.ex. människans hår) både vid basen och spetsen av palps (Figur 3D). Den sida tejp används som en förvaringsplats för tunna strängar, medan den centrala bandet behöver bytas efter varje inspelning (figur 3C).
6. Inspelning Drosophila melanogaster
- Placera objektglaset i mikroskop (Figur 4A) vid låg förstoring och placera antennen ungefär i mitten av synfältet (FOV) (Figur 4B). Lägg försiktigt ner elektroderna så att hänvisningen elektroden ligger nära öga flyger och inspelningen elektroden är nära antennen (Figur 4C). Öka förstoringen och åter placera antennen i mitten av FOV (Figur 4D).
- Placera lukt nära leverans enhet mot huvudet på flugan och pekade på antennen.
- Vid låg förstoring (Figur 4C), sätt i referenselektrod in i ögat på flugan. Sänk inspelning elektroden ovanpå antennen utan att vidröra ytan.
- Byta till hög förstoring, kontrollera inspelningen elektroden med mikromanipulator och sätt in det i en markerad sensillum (Figur 4D). Valfri punkt längs sensillum längden är bra för inspelning. Väl inne i sensillum, kan elektroden pressas längre in (ibland hela vägen)att få en bättre signal-brus-förhållande. När elektroden är i sensillum, kan den spontana aktiviteten av de celler detekteras.
7. Inspelning Anopheles gambiae
- Placera objektglas under mikroskop vid låg förstoring (10x) och placera överkäken palps ungefär i mitten av FOV och huvudet längst upp (Figur 4E). Rotera scenen tills en av palps är i en rät vinkel med inspelningen elektroden.
- Justera höjden av elektroderna så att hänvisningen elektroden är placerad precis ovanför ögat av mygg och inspelningen elektroden är nära maxillary palps.
- Placera enheten lukt leveransen så att den är så nära som möjligt palps.
- Sätt referenselektrod in i ögat vid lägre förstoring (10x) och byta till högre förstoring (100x), sätter inspelningen elektroden i PEG sensillum på KÄNSELSPRÖT (Figur 4F). När elektroden är i sensillum, kan den spontana aktiviteten av de celler detekteras.
8. Representativa resultat
Beroende på sensillum och kvaliteten på inspelningen kan man urskilja olika antal luktsinnet nervceller i ett enda spår. I den stora basiconic sensilla av Drosophila melanogaster, till exempel, bör mellan 2 och 4 celler som skiljer sig i spetsen amplituden visas under inspelningen 9, 10.
I vår video experiment visar Drosophila AB2 sensillum två celler, en en cell (Figur 5, blå spikar) och en B-cell (Figur 5, gröna sädesax). Varken celler aktiveras vid tillämpning av paraffinolja (Figur 5a), medan endast en cell svarar på 10 -6 utspädning av metylacetat (Figur 5B).
I maxillary KÄNSELSPRÖT av Anopheles gambiae innehåller räfflad pinne sensillum tre celler, men bara två är lätta att diskrimineras (Figur 5C, blå och gröna sädesax, respektive). I videon experiment visar vi hur B-celler reagerar på en 10 -7 utspädning av 1-okten-3-ol (Figur 5D).
Figur 1. Elektrod bryne
(A) överblick över elektroden bryne apparaten. (B) spruta med 0,5 M KOH (vänster) används för att slipa elektroden (höger). (C) Närbild av elektroden spetsen intill öppnandet av sprutan.
Figur 2. Hur man förbereder en fluga aspirator och mygga aspirator
(A) Starta material:... Luftledningen plastslang, två skär pipettspetsar, och mesh (B) Flugan aspirator när den är färdig (C) Detalj av slutet som används för att fånga vinäger flugor (D) Detalj av den andra änden av flugan aspirator. (E) Den elektriska aspirator för mygga kollektion består av en huvudenhet och en avtagbar plast bur. (F) Den löstagbara plast bur för myggor.
Figur 3. Förbereda en vinäger fluga (Drosophila melanogaster) och en malariamyggan (Anopheles gambiae) för inspelning
(A) Bild på en vinäger fluga monterad på bilden innan du placerar den i mikroskop. (B) Närbild av vinäger flyga huvudet med antennen hålls på plats av glaset kapillär. (C) Bild på en mygga monterad på i bilden. (D) Närbild av mygga huvudet med snabel och palps fastnar på bandet.
Figur 4. Inspelning från en vinäger fluga (Drosophila melanogaster) och en malariamyggan (Anopheles gambiae)
(A) Vy över elektrofysiologi installationen. (B) Närbild av flugan preparatet monteras på mikroskopet. Lägg märke till de olika positionerna för inspelningen elektrod (till vänster), lukten leverans systemet (mitten pipett) och inspelningen elektroden (höger). (C) Bild av flugan under 10x målet. (D) Bild av flugan antennen i det 100x mål,. stora basiconic sensilla (pilar), varvat bland icke-sensoriska hår (pilspetsar) (E) 10x bild av en mygga monteras för inspelning (F) Hög förstoring bild av mygga KÄNSELSPRÖT och en pinne sensillum (pil). .
Figur 5. Exempel på inspelningar från Drosophila melanogaster ochAnopheles gambiae
(A) AB2 sensillum av Drosophila melanogaster hus två sensoriska neuroner,.. I en cell (blå spikar) och B-celler (gröna sädesax) (B) A-och B-celler vid tillämpning av 10 -6 metylacetat (C) peg sensillum av Anopheles gambiae hus två sensoriska neuroner, A-cell (blå spikar) och B-celler (gröna sädesax) (D) Tillämpningen av 10 -7 1-okten-3-ol att de PEG sensillum..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lukt signaler används av organismer för att identifiera födokällor, potentiella kompisar och rovdjur. Olfactory sensoriska neuron (OSN) är det första reläet centrum mellan yttre stimuli och högre centra i hjärnan där informationen bearbetas ytterligare. I Drosophila melanogaster och Anopheles gambiae, OSN är lättillgängliga och deras elektriska aktivitet kan övervakas samtidigt stimuleras av lukt puffar.
Den enda sensillum inspelningen (SSR) teknik som beskrivs i denna video har i stor utsträckning använts för att spela in från OSN och studera deras elektriska svar på ett stort antal doftämnen 6, 7. Den deorphanization av luktreceptorer (ORS) 6, 11 och kartläggning av yttersta randområdena till specifika platser på Drosophila antenn 9, 12, 13 har gjort SSR tekniken ett kraftfullt verktyg för att analysera elektrofysiologiska egenskaperna av specifika yttersta randområdenas in vivo, som ett första steg för att förstå hur externa lukt världen översätts till elektriska signaler genom sin OSN och så småningom uppfattas av djuret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin oil | Odors | Fluka | 76235 | |
| High purity odors (>98%) | Odors | Sigma-Aldrich | Methyl acetate #296996 1-octen-3-ol #74950 |
|
| Filter paper strips | Odors | Fisher Scientific | 05-714-1 | Chromatography paper |
| Connectors | Odors | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Glass vials | Odors | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Air line plastic tubing | Odor Delivery | Python Products | 500PAL | |
| 1 serological pipette | Odor Delivery | Corning | 4101 | 10 mL |
| Plastic tubing | Odor Delivery | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes | Odor Delivery | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 inches |
| Programmable stimulus controller | Odor Delivery | Syntech | CS-55 | |
| Anti-vibration table | Electrophysiology Equipment | TMC | 63533 | 36”Wx30”Dx29”H |
| Faraday cage | Electrophysiology Equipment | TMC | MI8133303 | |
| Inverted microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Recording microscope |
| 10x and 100x objectives | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Dissecting microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | EZ645 | electrode sharpening/insect prep microscope |
| Magnetic stands | Electrophysiology Equipment | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Electrophysiology Equipment | Syntech | IDAC-4 | |
| Acquisition software | Electrophysiology Equipment | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulator | Electrophysiology Equipment | Narishige International | MN-151 | Joystick manipulator Used for positioning reference electrode |
| 1 micromanipulator | Electrophysiology Equipment | EXFO | PCS-6000 | Used for positioning recording electrode |
| Crocodile clip | Electrophysiology Equipment | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Electric cable | Electrophysiology Equipment | Pomona | B-36-0 | Test Cable Assembly |
| 2 electrode holders | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode |
| AC probe | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Universal single ended probe (10xAC) |
| Tungsten electrodes | Electrophysiology Equipment | Microprobes | M210 | straight tungsten rods, 0.005x3 |
| Potassium hydroxide | Electrophysiology Equipment | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Syringe | Electrophysiology Equipment | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Power supply | Electrophysiology Equipment | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Vertical puller | Insect prep | Narishige International | PB-7 | |
| Razor blade | Insect prep | VWR international | 55411-050 | |
| Dental wax | Insect prep | Patterson | 091-1503 | |
| Microscope slide | Insect prep | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cover glass | Insect prep | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Polypropylene mesh | Insect prep | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Glass electrode | Insect prep | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm |
| Double-sided tape (3M) | Insect prep | 3M | MMM6652P3436 | Double-sided tape (3M) |
| Forceps | Insect prep | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 Mirror Finish Forceps |
| Small plastic cup | Insect prep | VWR international | 89009-662 | 7 x 5.7 (23/4 x 21/4) |
| Electric aspirator | Insect prep | Gempler’s | RHM200 |
References
- Boeckh, J. Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Geruchsrezeptoren auf der Antenne des TotengrAbers (Necrophorus Coleoptera). Z. Vergl. Physiol. 46, 212-248 (1962).
- Schneider, D., Hecker, E. Zur Elektrophysiologic der Antenne des Seidenspinners Bombyx mori bei Reizung mit angereicherten Extrakten des Sexuallockstoffes. Z. Naturforschg. 11b, 121-124 (1956).
- Touhara, K., Vosshall, L. B. Sensing odorants and pheromones with chemosensory receptors. Annu Rev Physiol. 71, 307-332 (2009).
- Sato, K. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452, 1002-1006 (2008).
- Wicher, D. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452, 1007-1011 (2008).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Boeckh, J., Kaissling, K. E., Schneider, D. Insect olfactory receptors. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 30, 263-280 (1965).
- de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
- Lu, T. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Curr Biol. 17, 1533-1544 (2007).
- Hallem, E. A., Fox, A. N., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant. Nature. 427, 212-213 (2004).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. M. olecular anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr. Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Fishilevich, E., Vosshall, L. B. Genetic and functional subdivision of the Drosophila antennal lobe. Curr Biol. 15, 1548-1553 (2005).
