Summary
Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.
Abstract
Dorsale commissural axonen in de gewervelde ruggenmerg 1 zijn een onschatbare waarde model systeem in te axon begeleiding signalen te identificeren. We beschrijven hier een in vitro test, "de heroriëntatie assay", dat is uitgebreid gebruikt om het effect van extrinsieke en intrinsieke signalen studie over de oriëntatie van commissural axonen 2. Deze test werd ontwikkeld door een groot aantal mensen in de laboratoria van Jane Dodd, Thomas Jessell en Andrew Lumsden (zie erkenningen voor meer details) en de versies van deze test werden gebruikt om de heroriëntatie van de belangrijkste activiteiten axon begeleiding moleculen aan te tonen, waaronder de BMP chemorepellent in de dakplaat 3,4 en de chemoattractive activiteiten van Netrin1 5 en Sonic Hedgehog (Shh) 6 in de vloerplaat in het ruggenmerg.
Explantaten bestaande uit 2-3 segmenten van de dorsale tweederde van het ruggenmerg zijn ontleed uit embryonale dag (E) 11 ratten en gekweekt in driedimensionale collageen gels 7. E11 dorsale wervelkolom explantaten bevatten pasgeboren commissural neuronen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun axonale expressie van het glycoproteïne, Tag1 8. In de loop van 30-40 uur in de cultuur, is de commissural axon traject samengevat in deze dorsale explantaten met een tijdsverloop vergelijkbaar met dat in vivo. Dit axonale traject kan worden aangevochten door het plaatsen van een te testen weefsels of een COS-cel aggregaat uiten van een kandidaat signaalmolecuul in contact met een van de zijkanten van de dorsale explantaat. Commissural axonen te breiden in de omgeving van de bijgevoegde weefsel zal groeien onder invloed van zowel de endogene dakplaat en de signalen van de ectopische laterale weefsel. De mate waarin commissural axonen worden geheroriënteerd onder deze omstandigheden kunnen worden gekwantificeerd. Met behulp van deze test, is het mogelijk zowel te onderzoeken of het toereikendheid van een bepaald signaal om te heroriënteren commissural axonen 3,4 en de noodzaak voor dit signaal aan de commissural traject 9 direct.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van aggregaten van getransfecteerde COS-cellen met behulp van Opknoping Drops
- Zaad COS-7 (COS) cellen in 35mm cultuur gerechten. Als ze 80% confluentie, transfecteren 1μg van de expressie plasmide in de cellen met behulp van Lipofectamine2000 volgens de fabrikant s-protocol te bereiken.
- Ter voorbereiding opknoping daalt, zuigen de transfectie medium en spoel de getransfecteerde COS cellen met 1 ml 1x fosfaat gebufferde oplossing (PBS). Behandel cellen met 0,5 ml van het enzym-gratis mobiele dissociatie medium voor 15 minuten. Voeg 1 ml van een oplossing van Opti-MEM + 1x penicilline / streptomycine / Glutamine (P / S / G) + 10% foetaal runderserum (FBS) om de reactie te stoppen.
- Vermaal de cellen om ze te verwijderen van het oppervlak van de cultuur schotel en in een 15 ml conische buis te brengen. Spin 2 minuten bij 2000K tot pellet de cellen. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100μl van Opti-MEM + 1x P / S / G + 10% FBS.
- Spot meerdere 20μl druppels op de binnenkant van een 35mm cultuur schaal deksel, draai het deksel en plaats op de top van de bodem van de schaal en laat in een 37 ° C incubator gedurende enkele uren totdat de cellen aggregaat.
Deel 2: Bereiding van Dorsale ruggenmerg Explantaten
- Ontleden E11 rat embryo's uit de baarmoeder van de moeder en te houden op het ijs in L15 medium totdat het nodig is.
- Met een scherpe wolfraam naald, verwijder dan een 4-6 segment gedeelte uit de stam van elk embryo, uit de streek direct onder voorpoot knop. Met behulp van een plastic pipet, het verzamelen van het weefsel stuks in een put van een 4-goed Nunc schotel en te houden op het ijs.
- Als alle embryo segmenten zijn ontleed, gebruik dan de plastic pipet om de stukken te zetten in een oplossing van 1 ml L15 + 1 mg dispase in een tweede put van de Nunc schotel. Incubeer bij kamertemperatuur niet langer dan 5 minuten. Niet te broeden het weefsel stukken met dispase.
- Tijdens de incubatie, voeg 0,5 ml van de warmte geïnactiveerd normaal geit serum (HIGS) tot ongeveer 10 ml van L15 in een petrischaal en swirl te mengen. Overdracht 1 ml van deze oplossing in een derde bron van de Nunc schotel en giet het weefsel stukjes in deze oplossing als de incubatie voorbij is. Te houden op het ijs. Let op: de volgende sectie wordt gemakkelijker als het weefsel stukken mogen "rust" op ijs voor een uur.
Deel 3: Priming Collageen
- Voeg 40μl 10x Minimal Essential Medium tot 360μl collageen, snel en grondig mengen door de knop of kort vortexen de buis. Snel spin down in een picofuge. De oplossing wordt geel. Blijf op ijs zo veel mogelijk.
- Voeg genoeg 0,8 M natriumbicarbonaat (NaHCO 3) om de collageen-oplossing een beetje oranje (zie toelichting hieronder). Nogmaals, snel en grondig mengen door de knop, en een korte spin down in een picofuge. Als de oplossing nog steeds roze na het mengen, heb je toegevoegd te veel NaHCO 3 en zal opnieuw moeten beginnen met een nieuwe buis van collageen.
- Op dit punt de collageen-oplossing is gevuld. Het zal vloeibaar blijven op het ijs, maar zal stollen in ongeveer 5 minuten (draaien roze) als op kamertemperatuur gebracht.
- Spot 20μl van collageen in elke well van een 4-goed Nunc schotel. Met behulp van de punt van je pipet, verspreid het collageen om een kleine "pad" te vormen. Laat het collageen op kamertemperatuur.
Opmerking: Het exacte bedrag van NaHCO 3 zal moeten worden getitreerd voor elke partij van collageen. Start laag (11μl) en voeg vervolgens 0,5-1μl stapsgewijs tot de oplossing is een lichte tint oranje. De "juiste" hoeveelheid is meestal 1ul minder dan de kleinste hoeveelheid NaHCO 3, dat het collageen roze zou blijken. De hoeveelheid NaHCO 3 niet schaal lineair omhoog of omlaag.
Deel 4: Dissectie van Dorsale ruggenmerg Explantaten en de positionering van hen met COS Cell Aggregaten in Collageen Matrix
- Met behulp van een vers geslepen wolfraam naald en een paar fijne pincet (# 5 of # 55), verwijder de mesoderm rond het ruggenmerg.
- Snijden parallel aan de vloer plaat met de wolfraam naald, verwijder voorzichtig de ventrale vijfde van het ruggenmerg.
- Halveren van de dorsale wervelkolom explantatie en zorg ervoor dat randen zijn zo schoon mogelijk te snijden. Re-trim de randen, indien nodig. Breng elke dorsale wervelkolom explantatie op aparte collageen pads met behulp van een pipet mond voorzien van een glazen capillaire buis getrokken tot ca.. 0,5 mm in diameter.
- Snijd het totaal van getransfecteerde COS-cellen in vierkanten van ongeveer dezelfde breedte als de laterale rand van de dorsale wervelkolom explantaat.
- Overdracht van een van deze pleinen op het collageen pad met de dorsale wervelkolom explantatie, met behulp van een pipet mond.
- Met de mond pipet, zuig overtollige vloeistof via de mond pipet. Niet meer dan aspireren.
- Van toepassing zijn 4μl van collageen voorbereid op het pad, en met behulp van de wolfraam naaldBeweeg de collageen over de explantaten zonder direct aan te raken het weefsel. Door het verplaatsen van de wolfraam naald in het collageen rond de explantaten, oriënteren de explantaten, zodat de COS-cellen aggregaat grenst aan de laterale rand van de dorsale wervelkolom explantaat.
- Nadat de collageen heeft, herhaal dan de toepassing van 4μl van collageen om ervoor te zorgen dat de explantaten zijn volledig ingekapseld in het collageen.
- In een weefselkweek kap, voeg 0,5 ml van de Opti-MEM + 1xP/S/G en cultuur voor 30-40 uur.
- Fix explantaten gedurende 45 minuten met 0,5 ml 4% paraformaldehyde in 1xPBS, waardoor de plaat op het ijs.
- Was tweemaal met 0,5 ml van een blokkerende oplossing van 1xPBS + 0,1% Triton-X100 +1% HIGS (PBTN). Blok bij 4 ° C gedurende ten minste een paar uur, een nacht incubatie de voorkeur en vervolgens proces door immunohistochemie.
Deel 5: Visualisatie van Commissural Axonen door immunohistochemie
- Na het blokkeren in PBTN, snijd de explantaten van de 4 wells plaat met een pincet en plaats in een 48-well schotel.
- Voeg 200μl van primaire antilichamen aan elk putje en laat het een nacht bij 4 ° C. Te visualiseren commissural axonen, gebruik dan een 1:06 oplossing van muis anti-Tag1 antilichaam. Om te bepalen of de transfectie succesvol was, ook een primair antilichaam tegen ofwel het signaalmolecuul wordt getest, of de desbetreffende epitoop als het signaalmolecuul is epitoop gemerkt.
- Was elk monster voor 5 x 1 uur in PBTN bij 4 ° C.
- Voeg 200μl van secundaire antilichaam aan elk putje en laat het een nacht bij 4 ° C. Als anti-Tag1 antilichamen werden gebruikt als het primaire antilichaam, gebruik dan een geit anti-muis IgM secundair antilichaam gekoppeld aan ofwel FITC of Cy3. Bij gebruik van lichtgevoelige secundaire antilichamen gekoppeld aan FITC of Cy3, houden de 48-well schaal bedekt met folie vanaf dit moment.
- Was elk monster 5 x 1 uur per in PBTN bij 4 ° C.
- Overdracht explant met een 3-goed depressie glijbaan, verwijder overtollige vloeistof, monteren in Vectashield medium en dekglaasje aan. Bewaren in een licht kluis op een van beide 4 ° C of -20 ° C.
Deel 6: Vertegenwoordiger Beelden van Explantaten
In een geslaagd experiment, zal de Explantatie en COS aggregaat blijven naast elkaar en niet drijven uit elkaar als de collageen sets. Er zal een minimale overmatige groei van axonen zijn; significant axonale begroeiing geeft aan dat de dorsale wervelkolom explantaat was gekweekt te lang. Er zullen geen blebs groeien van de explantatie; blebbing doet zich voor als het weefsel komt in direct contact met het kweekmedium.
Het vermogen van het signaalmolecuul om de axonen te heroriënteren wordt beoordeeld op basis confocale microscopie. De mate van axon heroriëntatie kan worden gekwantificeerd door het meten van de gemiddelde hoek van de heroriëntatie van de axonen het dichtst bij de COS cel aggregaat 3. Zoals weergegeven in figuur 1, COS-cellen die myc-tag BMP7 (blauw) weg te heroriënteren Tag1 + commissural axonen (groen) van de bron van BMP7 (Figuur 1B), vergelijkbaar met de wijze waarop een explantatie van de dakplaat afstoot commissural axonen (Figuur 1A). COS cellen die een controle vector hebben geen effect op de oriëntatie van commissural axonen 3,4. Deze explantaten werden ook voorzien van antilichamen tegen de transcriptiefactor Isl1 / 2 (rood), die motorneuronen en interneuronen dorsale siert. Dit resultaat was de eerste aanwijzing dat een lid van de BMP familie bemiddelt de activiteit van de dakplaat chemorepellent 3.
Figuur 1: Gelieve klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische factoren die het succes bij het uitvoeren van deze test bepalen eerst worden, het weefsel niet moeten worden behandeld met dispase voor te lange periode, zal leiden tot een dergelijke behandeling in het weefsel steeds erg plakkerig en met verminderde levensvatbaarheid. Twee, moet het collageen perfect geprepareerd en bewaard op ijs zo veel mogelijk. Het zal steeds moeilijker te hanteren als het begint ingesteld, dat wil zeggen roze. Drie, moet de wolfraam naald altijd worden bewaard zeer scherp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit protocol werd ontwikkeld in de laboratoria van Jane Dodd, Thomas Jessell en Andrew Lumsden. Veel mensen, waaronder Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba en Toshiya Yamada bepaald hoe de cultuur explantaten van het ruggenmerg in collageen. Marysia Placzek en Marc Tessier-Lavigne een pionier in de techniek van het gebruik van axon groei van in vitro explantaten als een middel ter identificatie van axon begeleiding moleculen. Werk in het laboratorium Butler wordt ondersteund door subsidies van de March of Dimes en R01 NS063999 van NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
