Summary
Denna analys bedömer förmågan hos en signalmolekyl, här Benmorfogenetiska Protein 7 (BMP7), för att inrikta commissural axoner. En Explantation av embryonala dorsal ryggmärgen är odlade i anslutning till ett sammanlagt COS celler utsöndrar kandidaten tillväxtfaktorer. Omorienterat commissural axoner växer inom Explantation synliga genom immunohistokemi.
Abstract
Dorsal commissural axoner i ryggradsdjur ryggmärgen 1 har en ovärderlig modellsystem där för att identifiera signaler Axon vägledning. Här beskriver vi en in vitro ", den nya inriktningen assay", som har används i stor utsträckning för att studera effekten av yttre och inneboende signaler om inriktningen på commissural axoner 2. Denna analys har utvecklats av många personer i laboratorier Jane Dodd, Thomas Jessell och Andrew Lumsden (se erkännanden för mer information) och versioner av denna analys användes för att demonstrera omorientering verksamhet viktiga molekyler Axon vägledning, inklusive BMP chemorepellent i takplåt 3,4 och chemoattractive verksamhet Netrin1 5 och Sonic Hedgehog (Shh) 6 i golvet plattan i ryggmärgen.
Explants bestående av 2-3 segment på rygg två tredjedelar av ryggmärgen dissekeras från embryonala dag (E) 11 råttor och odlas i tredimensionell kollagen geler 7. E11 rygg spinal explants innehåller nyfödda commissural nervceller, som kan identifieras genom sina axonal uttryck för glykoprotein, Tag1 8. Under loppet av 30-40 timmar i kulturen, är commissural axonet banan rekapitulerade i dessa dorsal explants med en tid kursen liknar den som ses in vivo. Detta axonal bana kan utmanas genom att antingen testa vävnader eller en COS cell samlade uttrycker en kandidat signalmolekyl i kontakt med en av sidokanter rygg Explantation. Commissural axoner sträcker sig i närheten av den bifogade vävnad kommer att växa under inflytande av både de endogena takplåt och signaler från ektopisk laterala vävnad. I vilken grad commissural axoner är en ny inriktning under dessa omständigheter kan kvantifieras. Med hjälp av denna analys är det möjligt att både undersöka tillräckliga för en viss signal till omorientera commissural axoner 3,4 samt nödvändigheten av denna signal för att styra commissural bana 9.
Protocol
Del 1: Förberedelse av aggregat av transfekterade COS celler med hängande Drops
- Seed COS-7 (COS) celler i 35mm kultur rätter. När de når 80% confluency, transfektera 1μg av uttrycket plasmiden in i cellerna med hjälp av Lipofectamine2000 enligt tillverkarens s protokoll.
- För att förbereda hängande droppar, aspirera transfektion mediet och skölj transfekterade COS celler med 1 ml 1x Fosfatbuffrad Solution (PBS). Behandla celler med 0,5 ml enzym-fri ruta dissociation medium för 15 minuter. Tillsätt 1 ml av en lösning av Opti-MEM + 1x Penicillin / streptomycin / Glutamin (P / S / G) + 10% fetalt bovint serum (FBS) för att stoppa reaktionen.
- Mal sönder cellerna att ta bort dem från ytan av kulturen skålen och överför till en 15 ml koniska rör. Spin i 2 minuter vid 2000K till pellets cellerna. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100μl av Opti-MEM + 1x P / S / G + 10% FBS.
- Spot flera 20μl droppar på insidan av en 35mm kultur skål lock, vänd locket och placera på toppen av botten av skålen och lämna i en 37 ° C inkubator i flera timmar tills cellerna aggregat.
Del 2: Förberedelse av ryggfenan ryggmärg explants
- Dissekera E11 råtta embryon från livmodern hos modern och hålla på is i L15 medelstora tills det behövs.
- Med en skärpt volfram kanylen avlägsnas en 4-6 segment avsnitt från stammen av varje embryo från regionen omedelbart under forelimb knopp. Med hjälp av en plastpipetten, samla vävnaden bitarna i en brunn på en 4-väl Nunc rätt och hålla på is.
- När alla embryot segment har dissekeras, använd plastpipetten att överföra bitar till en lösning av 1 ml L15 + 1mg dispase i en andra brunn på Nunc skålen. Inkubera vid rumstemperatur i högst 5 minuter. Inte över inkubera vävnaden bitar med dispase.
- Under inkubationen, tillsätt 0,5 ml värmeinaktiverad normala get serum (HIGS) till ca 10 ml L15 i en petriskål och snurra för att blanda. Överför 1 ml av denna lösning till en tredje brunn på Nunc skålen och överför vävnaden bitarna i denna lösning när inkubationstiden är över. Håll på is. Obs: den efterföljande dissektionen blir lättare om vävnaden bitarna är tillåtet att "vila" på is i en timme.
Del 3: Grundning Kollagen
- Lägg 40μl 10x Minimal Essential Medium till 360μl kollagen, blanda snabbt och grundligt genom att ställa eller kort vortexa röret. Spinn ner snabbt i en picofuge. Lösningen kommer att vara gul. Kom på is så mycket som möjligt.
- Lägg tillräckligt med 0,8 natriumbikarbonat (NaHCO 3) för att slå på kollagen lösningen svagt orange (se nedan). Återigen, blanda snabbt och grundligt genom att ställa, och spinn ner kort i en picofuge. Om lösningen förblir rosa efter blandningen, har du lagt för mycket NaHCO 3 och kommer att behöva börja om med en ny tub av kollagen.
- Vid denna punkt kollagen lösningen är laddad. Det kommer att förbli flytande på is, men kommer att stelna i ca 5 minuter (vänder rosa) då de kom till rumstemperatur.
- Spot 20μl av kollagen i varje brunn i en 4-väl Nunc skålen. Hjälp av spetsen på din pipett utspridda kollagen att bilda en liten "pad". Låt kollagen som vid rumstemperatur.
Obs: Det exakta NaHCO 3 kommer att behöva titreras för varje parti kollagen. Start låg (11μl) och lägg sedan till 0,5-1μl stegvis tills lösningen är en liten nyans av orange. "Rätt" belopp är oftast 1ul mindre än den minsta NaHCO 3 som skulle vända kollagen rosa. Mängden NaHCO 3 har skalan inte linjärt upp eller ner.
Del 4: dissekering av ryggfenan Spinal Cord explants och positionering av dem med COS cellaggregat i kollagenmatrisen
- Med hjälp av en nyligen skärpt volfram nål och ett par fina peang (# 5 eller # 55), ta bort mesoderm kring ryggmärgen.
- Kapning parallellt med golvet plattan med volfram nålen, försiktigt bort den ventrala femtedel av ryggmärgen.
- HALVERA rygg spinal Explantation, se till att kanterna är så renskuren som möjligt. Re-trim kanterna om det behövs. Överför varje bröst spinal Explantation på separata kollagen kuddar med en mun pipett försedd med ett glas kapillärrör dras till ca. 0,5 mm i diameter.
- Skär den sammanlagda transfekterade COS celler i rutor av ungefär samma bredd som den laterala kanten av rygg-spinal Explantation.
- Överför en av dessa rutor på kollagen kardborrebandet med rygg-spinal Explantation, med en mun pipett.
- Med munnen pipett aspirera bort överflödig vätska med hjälp av munnen pipett. Inte över aspirera.
- Applicera 4μl av grundmålade kollagen på pad, och med hjälp av volfram nålFlytta kollagen över explants utan att direkt vidröra vävnaden. Genom att flytta volfram nålen i kollagen som omger explants, orientera explants så att COS celler sammanlagda ligger i anslutning till den laterala kanten av rygg-spinal Explantation.
- När kollagen har satt, upprepa tillämpningen av 4μl av kollagen för att säkerställa att explants är helt inneslutna i kollagen.
- I en vävnadskultur huva, tillsätt 0,5 ml Opti-MEM + 1xP/S/G och kultur i 30-40 timmar.
- Fix explants i 45 minuter med 0,5 ml 4% paraformaldehyd i 1xPBS, hålla plattan på is.
- Tvätta två gånger med 0,5 ml av en blockerande lösningen av 1xPBS + 0,1% Triton-X100 1% HIGS (PBTN). Block vid 4 ° C under minst ett par timmar, är en övernattning inkubation föredra och sedan processen genom immunohistokemi.
Del 5: Visualisering av commissural Axoner av Immunohistokemi
- Efter blockering i PBTN sänkte explants ur fyra brunnar med tång och lägg i en 48-bra maträtt.
- Tillsätt 200μl av primära antikroppar i varje brunn och lämna över natten i 4 ° C. Att visualisera commissural axoner, använd en 1:06 lösning av mus-anti-Tag1 antikropp. För att avgöra om transfektion var lyckad, även en primär antikropp mot antingen signalmolekyl som testas, eller om relevanta epitopen om signalmolekyl har epitop taggat.
- Tvätta varje prov i 5 x 1 timme i PBTN vid 4 ° C.
- Tillsätt 200μl av sekundär antikropp till varje brunn och låt över natten vid 4 ° C. Om anti-Tag1 antikroppar användes som den primära antikroppen, använd en get anti mus-IgM sekundär antikropp kopplad till antingen FITC eller Cy3. Om du använder ljuskänsliga sekundära antikroppar kopplade till FITC eller Cy3, håll 48-bra skål täckt i folie från och med nu.
- Tvätta varje prov 5 x 1 timme vardera PBTN vid 4 ° C.
- Överför Explantation till en 3-väl depression bild, ta bort överflödig vätska, montera i Vectashield medellång och täckglas. Förvara i en ljus kassaskåp på antingen 4 ° C eller -20 ° C.
Del 6: Representant Bilder av explants
I ett lyckat experiment kommer Explantation och COS sammanlagda kvar bredvid varandra och inte glida isär som kollagen uppsättningar. Det kommer att vara minimala överväxt av axoner, signifikant axonal överväxt indikerar att ryggens spinal Explantation var odlade för länge. Det blir ingen blebs växer från Explantation, blebbing sker om vävnaden kommer i direkt kontakt med substratet.
Förmågan hos signalmolekyl för att inrikta axoner bedöms med hjälp av konfokalmikroskopi. Omfattningen av Axon omorientering kan kvantifieras genom att mäta den genomsnittliga vinkel omorientering av axoner närmast COS cellen aggregat 3. Som visas i figur 1, COS celler som uttrycker Myc-märkta BMP7 (blå) omorientera Tag1 + commissural axoner (grön) från källan till BMP7 (Figur 1B) som liknar den som som en explantation av takplåt repellerar commissural axoner (Figur 1A). COS celler som uttrycker en kontroll vektor har ingen inverkan på inriktningen av commissural axoner 3,4. Dessa explants var också märkta med antikroppar mot transkriptionsfaktor Isl1 / 2 (röd), som pryder motoriska nervceller och dorsala interneuronen. Detta resultat var den första indikation på att en medlem av BMP-familjen förmedlar aktivitet takplåt chemorepellent 3.
Figur 1: Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska faktorer som avgör framgång i att utföra denna analys är det första bör vävnaden inte behandlas med dispase under alltför lång en period, kommer en sådan behandling resultera i vävnaden blir mycket trög och har minskat lönsamheten. Två måste kollagen vara helt förberedd och förvaras på is så mycket som möjligt. Det blir allt svårare att hantera om det börjar att ställa in, dvs bli rosa. Tre måste volfram nål alltid hållas mycket skarp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta protokoll utvecklades i laboratorier Jane Dodd, Thomas Jessell och Andrew Lumsden. Många människor, däribland Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz jag Altaba och Toshiya Yamada bestäms hur kulturen explants av ryggmärgen i kollagen. Marysia Placzek och Marc Tessier-Lavigne var först med tekniken att med hjälp av axonet tillväxt in vitro explants som ett sätt att identifiera molekyler Axon vägledning. Arbetet i Butler laboratoriet stöds med bidrag från March of Dimes och R01 NS063999 från NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
