Gendeletion och protein överuttryck är vanliga metoder för att studera funktionen av proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för analys av fenotyp utveckling som en funktion av protein koncentration på befolkning och encelliga nivåer i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Gendeletion och protein överuttryck är vanliga metoder för att studera funktionen av proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för analys av fenotyp utveckling som en funktion av protein koncentration på befolkning och encelliga nivåer i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Även om detta protokoll är baserad på överuttryck av ett protein, kan den enkelt anpassas för morfologisk fenotyp beroende på hämning av protein uttryck. Vårt labb är intresserade av att studera signalering egenskaper endocytic adaptern proteinet epsin. För detta ändamål använde vi en dominerande negativa förhållningssätt där vi över-uttryckte bevaras<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (ENTH) domän för att störa funktioner endogena epsin-2 (Ent2 eller YLR206W). Vi konstaterade att överuttryck av ENTH domän Ent2 (ENTH2) i vild typ celler ledde till en celldelning fel som är beroende av mislocalization av en familj av byggnadsställningar proteiner, septins.
Protocol
A. cellkultur och Protein Induktion Detta avsnitt beskriver förutsättningarna cellodling, cell-cykel synkronisering med Nocodazole, följt av induktion av protein uttryck från en som kan ställas promotor i jästceller. Den vilda typen jäst stam W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) omvandlas med hög kopia (2μ) plasmid-DNA som innehåller vår genen av intresse (ENTH2) under kontroll av metionin-repressible promotor (MET25). 2mm metio…
Discussion
Detta protokoll beskriver hur du följa utvecklingen av en morfologisk fenotyp (jäst cell kan genomgå ordentlig celldelning) vid protein överuttryck. När du gör detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att skörda jästceller genom pelletering i rekommenderad centrifugeringsvarvtal som högre hastigheter kan skada celler och oklara resultat. Metylenblått och Calcofluor vita bör läggas till levande celler strax före avbildning som de är giftiga. Detta förfarande kan också lätt anpassas för fenotype…
Acknowledgements
Vi tackar Brian G. Coon och Claudia B. Hanna för hjälpsamma diskussioner och stöd. Projektet fick stöd av uppstart medel från Inst. of Biological Sciences, Purdue University till R. Claudio Aguilar och en American Cancer Society institutionell forskning Bidrag till R. Claudio Aguilar via Purdue Cancer Center.
Gietz, R. D., Woods, R. A. .High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
Mukherjee, D., Sen, A., Aguilar, R. C. Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (37), e1863, doi:10.3791/1863 (2010).