Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi
Summary
Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Bu protokol bir proteinin aşırı ekspresyonu dayalı olmasına rağmen, protein ekspresyonu baskılanması bağlı morfolojik fenotipleri için kolayca adapte olabilir. Bizim laboratuvar endositik adaptör protein epsin sinyal özelliklerini inceleyerek ilgileniyor. Bu amaç için korunmuş fazla dile getirdiği baskın bir olumsuz yaklaşım kullanıldı<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (ENTH) etki alanı endojen epsin-2 (Ent2 veya YLR206W) fonksiyonları ile müdahale edebilmek için. Biz iskele proteinler, septins bir ailenin mislocalization bağımlı bir hücre bölünmesi kusur yol açan vahşi tip hücrelerde Ent2 (ENTH2) ENTH etki bu aşırı ekspresyonu gözlemledi.
Protocol
Discussion
Bu protokol, protein aşırı ekspresyonu üzerine morfolojik bir fenotip (uygun hücre bölünmesi geçmesi mümkün maya hücresi) gelişimini izlemek anlatılmaktadır. Bu işlemi yaparken, daha hızlı ve belirsiz sonuçlar hücreleri zarar verebilir olarak tavsiye santrifüj hızda peletleme maya hücreleri hasat hatırlamak önemlidir. Metilen mavisi ve Calcofluor beyaz toksik olarak hemen önce görüntüleme hücreleri yaşamak için ilave edilmelidir. Bu işlem aynı zamanda kolayca hedef kontrollü bir organiz…
Acknowledgements
Brian G. Coon ve Claudia B. Hanna yararlı tartışmalar ve destek için teşekkür ederiz. Bu proje, Dep start-up fonları tarafından desteklenen. Biyolojik Bilimler, Purdue Üniversitesi R. Claudio Aguilar ve R. Claudio Aguilar Purdue Kanser Merkezi aracılığıyla bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
References
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
