Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine in lievito
Summary
Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine a popolazione e monocellulari livelli<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine a popolazione e monocellulari livelli<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Anche se questo protocollo si basa sulla sovraespressione di una proteina, può essere facilmente adattato per fenotipi morfologici dipende soppressione della espressione proteica. Il nostro laboratorio è interessato a studiare le proprietà di segnalazione delle epsin endocitico proteina adattatore. A tal fine abbiamo utilizzato un approccio dominante negativa in cui siamo sovra-espresso il conservati<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (settimo) dominio al fine di interferire con le funzioni di endogeno epsin-2 (o Ent2 YLR206W). Abbiamo osservato che l'iperespressione del dominio settimo di Ent2 (ENTH2) nelle cellule wild-type ha portato a un difetto di divisione cellulare, che dipende dalla mislocalization di una famiglia di proteine ponteggi, septins.
Protocol
Discussion
Questo protocollo descrive come monitorare lo sviluppo di un fenotipo morfologico (cellula di lievito in grado di sottoporsi corretta divisione cellulare) al momento della sovraespressione proteica. Nel fare questa procedura è importante ricordarsi di raccogliere le cellule di lievito da pellettatura alla velocità di centrifugazione raccomandata come velocità più elevate possono danneggiare le cellule ed i risultati oscuri. Blu di metilene e Calcofluor bianco deve essere aggiunto a vivere le cellule appena prima di …
Acknowledgements
Ringraziamo Brian G. Coon e Claudia B. Hanna per le discussioni utili e supporto. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di start-up dal Dep. di Scienze Biologiche, la Purdue University di Claudio R. Aguilar e un americano Cancer Society istituzionali Research Grant a Claudio R. Aguilar attraverso il Centro Purdue Cancro.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
References
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