Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento
Summary
Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Embora este protocolo é baseado na superexpressão de uma proteína, que pode facilmente ser adaptado para fenótipos morfológicos dependente supressão da expressão da proteína. Nosso laboratório está interessado em estudar as propriedades de sinalização do epsin endocítica adaptador de proteína. Para esse fim foi utilizada uma abordagem dominante negativo em que expressou a over-conservada<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology domínio (ENTH), a fim de interferir com as funções de endógenos epsin-2 (Ent2 ou YLR206W). Observamos que a superexpressão do domínio ENTH de Ent2 (ENTH2) em células de tipo selvagem levou a um defeito de divisão celular que é dependente do mislocalization de uma família de proteínas andaimes, septinas.
Protocol
Discussion
Este protocolo descreve como monitorar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico (célula de levedura capaz de se submeter a divisão celular propriamente dita) sobre superexpressão da proteína. Ao fazer este procedimento é importante para se lembrar de colher células de levedura por peletização na velocidade de centrifugação recomendada como velocidades mais rápidas podem danificar as células e os resultados obscuros. Azul de metileno e calcofluor branco deve ser adicionado ao vivo células pouco antes d…
Acknowledgements
Agradecemos a Brian G. Coon e Claudia B. Hanna para discussões úteis e de apoio. Este projecto foi apoiado pelo start-up fundos do Dep. de Ciências Biológicas, da Universidade Purdue de Claudio R. Aguilar e um American Cancer Society Research Grant Institucional de Claudio R. Aguilar através do Centro de Câncer Purdue.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
References
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