Linearisatie van de Bradford Protein Assay
Summary
De nauwkeurigheid en gevoeligheid van eiwit vaststelling door de snelle en handige Bradford assay in gevaar wordt gebracht door intrinsieke niet-lineariteit. We tonen een eenvoudige procedure die linearisatie verhoogt de nauwkeurigheid, verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, en vermindert de inmenging van wasmiddelen.
Abstract
Bepaling van de microgram hoeveelheden van eiwit in de Bradford Coomassie brilliant blue test wordt bereikt door het meten van absorptie bij 590 nm. Deze meest voorkomende test maakt een snelle en eenvoudige eiwitten kwantificering in cellysaten, cellulaire fracties, of recombinant eiwit samples, met het oog op normalisering van de biochemische metingen. Echter, een intrinsiek niet-lineariteit compromissen de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van deze methode. Er wordt aangetoond dat onder standaard testomstandigheden, de verhouding van de absorbantie metingen bij 590 nm en 450 nm is strikt lineair met eiwit concentratie. Deze eenvoudige procedure verhoogt de nauwkeurigheid en verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, waardoor de kwantificering tot 50 ng van runder serum albumine. Bovendien is de storing vaak geïntroduceerd door detergenten die gebruikt worden om de cellysaten creëren sterk verminderd door het nieuwe protocol. Een lineaire vergelijking ontwikkeld op basis van massa-actie en Beer de wet past perfect bij de experimentele data.
Protocol
Discussion
De Bradford eiwit assay is populair vanwege het gemak van de prestaties en de relatieve gevoeligheid. De linearisatie over het gehele eiwitconcentraties assortiment verkregen door het protocol hier gepresenteerde verder de assay vereenvoudigd, zoals de onbekende monsters hoeven niet te vallen binnen het bereik van de ijklijn.
Belangrijk is dat de verbeterde protocol biedt verder de volgende voordelen ten opzichte van de oorspronkelijke Bradford protocol:
- Verhoogde nauwkeurigheid…
Acknowledgements
Dit document is gewijd aan de nagedachtenis van wijlen dr. Zvi Selinger, die gastheer van de originele onderzoek hier beschreven.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bradford reagent | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | ||
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | ||
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
References
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).
