Summary

Linearisatie van de Bradford Protein Assay

Published: April 12, 2010
doi:

Summary

De nauwkeurigheid en gevoeligheid van eiwit vaststelling door de snelle en handige Bradford assay in gevaar wordt gebracht door intrinsieke niet-lineariteit. We tonen een eenvoudige procedure die linearisatie verhoogt de nauwkeurigheid, verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, en vermindert de inmenging van wasmiddelen.

Abstract

Bepaling van de microgram hoeveelheden van eiwit in de Bradford Coomassie brilliant blue test wordt bereikt door het meten van absorptie bij 590 nm. Deze meest voorkomende test maakt een snelle en eenvoudige eiwitten kwantificering in cellysaten, cellulaire fracties, of recombinant eiwit samples, met het oog op normalisering van de biochemische metingen. Echter, een intrinsiek niet-lineariteit compromissen de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van deze methode. Er wordt aangetoond dat onder standaard testomstandigheden, de verhouding van de absorbantie metingen bij 590 nm en 450 nm is strikt lineair met eiwit concentratie. Deze eenvoudige procedure verhoogt de nauwkeurigheid en verbetert de gevoeligheid van de test ongeveer een factor 10, waardoor de kwantificering tot 50 ng van runder serum albumine. Bovendien is de storing vaak geïntroduceerd door detergenten die gebruikt worden om de cellysaten creëren sterk verminderd door het nieuwe protocol. Een lineaire vergelijking ontwikkeld op basis van massa-actie en Beer de wet past perfect bij de experimentele data.

Protocol

Linearisatie van de Bradford Protein ijklijn: De Coomassie briljant blauw eiwit assay, algemeen bekend als de Bradford assay 1, wordt op grote schaal gebruikt vanwege de snelle en handige protocol, alsook de relatieve gevoeligheid. Helaas is er een grote mate van kromming over een breed scala van proteïne concentraties (afb. 1). Daarom is slechts een beperkt aantal relatief hoge concentraties van eiwitten, 2-10 mg / ml BSA, gebruikt voor de kalibratie grafiek, die beter past dan li…

Discussion

De Bradford eiwit assay is populair vanwege het gemak van de prestaties en de relatieve gevoeligheid. De linearisatie over het gehele eiwitconcentraties assortiment verkregen door het protocol hier gepresenteerde verder de assay vereenvoudigd, zoals de onbekende monsters hoeven niet te vallen binnen het bereik van de ijklijn.

Belangrijk is dat de verbeterde protocol biedt verder de volgende voordelen ten opzichte van de oorspronkelijke Bradford protocol:

  1. Verhoogde nauwkeurigheid…

Acknowledgements

Dit document is gewijd aan de nagedachtenis van wijlen dr. Zvi Selinger, die gastheer van de originele onderzoek hier beschreven.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bradford reagent   Bio-Rad Laboratories 500-0006  
Bovine Serum Albumin   Amersco 0332  
Multiplate absorbance reader   BioTek Synergy2  

References

  1. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  2. Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
  3. Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
  4. Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
  5. Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
  6. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).

Play Video

Cite This Article
Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918, doi:10.3791/1918 (2010).

View Video