Summary
Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.
Abstract
Cells ändern ausgiebig in ihren Standorten und Immobilien während der Embryogenese. Diese Veränderungen werden durch die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und ihrer Umgebung reguliert wird. Chimäre Embryonen, die aus Zellen verschiedener genetischer Hintergrund bestehen, sind großartige Werkzeuge, um die Zell-Zell-Interaktionen von Genen von Interesse vermittelt zu studieren. Die embryonale Transparenz der Zebrafisch am frühen Entwicklungsstadien ermöglicht die direkte Visualisierung der Morphogenese von Geweben und Organen auf der zellulären Ebene. Hier zeigen wir, ein Protokoll zu chimären Netzhaut und Gehirn in Zebrafisch-Embryonen zu erzeugen und zu leben Bildgebung des Spenders Zellen durchzuführen. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung auf die Transplantation Nadeln, die Transplantation von GFP-exprimierenden Spender Blastomeren zu GFP-negative Hosts und die Prüfung der Spender das Verhalten der Zelle unter Live-konfokale Mikroskopie. Mit leichten Modifikationen kann dieses Protokoll auch verwendet, um die embryonale Entwicklung von anderen Geweben und Organen im Zebrafisch zu untersuchen. Die Vorteile der Verwendung von GFP zu markieren Spenderzellen werden ebenfalls diskutiert.
Protocol
Tag 1. Vorbereitung
1. Set up Fisch Kreuze
Set up paarweise Kreuze Zebrafisch in den Abend. Um zu verhindern, zufällige Paarung vor der gewünschten Zeit nutzen, um so zu den weiblichen und männlichen Fischen in der Paarung Kassetten zu trennen. GFP-exprimierenden transgenen Fische sind als eine Quelle der Spender Blastomeren verwendet. Die pt104 transgene Linie (Zou et al., 2008), hier verwendet wird, drückt GFP ubiquitär unter der Kontrolle des EF1-Promotor. GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von Spenderzellen mit Live-Bildgebung. Andere transgene Fische Linien, die geeignete fluoreszierende Proteine exprimieren können für spezielle Bedürfnisse verwendet werden.
2. Bereiten keilförmige Agarose Brunnen für die Aufbewahrung des Embryos
Gießen geschmolzen 1% Agarose in E3 Ei Wasser (Westerfield, 2007) vorbereitet, in eine Petrischale. Float eine plastische Form, die keilförmigen Vorsprünge auf dem Agarose-Lösung und lassen Sie die Agarose-Lösung vollständig erstarren. Entfernen Sie den Schimmel vorsichtig und tauchen die Agarose Bett mit E3 Wasser.
3. Bereiten Transplantation Nadeln
Verwenden Sie eine vertikale Needle Puller (David Kopf Instruments) bei Leistungsstufe 11,5 auf Nadeln, indem Glaskapillare Pipetten (World Precision Instruments) zu machen. Gute Nadelspitzen sollte Kegel mit langen Wellen. Grind die Nadelspitzen in einem 45-Grad-Winkel mit einer Micro Grinder (Marishige) bis abgeschrägten Öffnungen der 40-45μm Innendurchmesser erhalten (Abb. 1A). So bereinigen Sie die Nadelspitzen, legen einen Schlauch an das stumpfe Ende der Nadel, verbinden Sie den Schlauch mit einer Spritze, und dann saugen und lassen Sie eine 10% ige Flusssäure-Lösung, bis alle sichtbaren Verschmutzungen entfernt. Anschließend waschen Sie sie mit destilliertem Wasser, um 100% Ethanol gefolgt. Der Luft trocknen die Nadeln, bis alle Ethanol verdunstet. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Spitzen trocken sind: Restethanol werden die Nadeln während der Hochtemperatur-Polierschritt ruinieren. Zu erweichen und zu polieren die Ecken und Kanten der Nadelspitzen, backen die Nadelspitzen mit der Wärme, die durch das Filament eines Micro Forger (Marishige) generiert. Lassen Sie sich nicht die Nadelspitzen berühren den Faden beim Polieren. Die Menge an Strom vorbei wenn der Faden und der Abstand zwischen dem Filament und die Nadelspitzen können angepasst werden, um gewünschte Erwärmung Bedingungen zu erreichen sein. Die Temperatur sollte nicht zu hoch sein: Dies wird schmelzen und verformen die Nadelspitzen. Nach der Ecken und Kanten geglättet sind, sorgfältig berühren Glühfaden mit der Nadelspitze und ziehen Sie dann vorsichtig den Faden von der Nadel zu einem spitzen Ende (Abb. 1B) zu generieren. Eine scharfe, glatte und saubere Nadel ist entscheidend für den Erhalt intakter Spender Blastomeren und nicht zu beschädigen den Host-Embryonen.
4. Bereiten Sie ein Embryo-Positionierung Sonde
Ziehen Sie eine Glaspipette über einer Gasflamme, um ein gutes Glas-Sonde mit einer geglätteten Ende erhalten. Diese Sonde wird verwendet, um die Embryonen in der richtigen Orientierung vor der Transplantation zu positionieren.
Tag 2. Blastomere Transplantation
1. Sammeln und dechorionate Embryonen
Am nächsten Tag, entfernen Sie die Trennwände in der cross-Kassetten für Fische zu paaren können. Legen Sie die Embryonen in einer Petrischale mit E3 Wasser gefüllt. Dann dechorionate Embryonen, die durch manuelle Abreißen der Chorion aus den Embryonen mit einer feinen Pinzette. Verwenden Sie eine Glaspipette mit gebogenem Schaft sorgfältig übertragen dechorionated Embryonen in Agarose Brunnen. Vermeiden Sie jeden Kontakt des Embryos mit der Luft, Ursache, welche die Embryonen zu platzen. Lassen Sie die Embryonen bei 28,5 ° C zu entwickeln in der Agarose Brunnen bis 3 Stunden nach der Befruchtung, oder hpf.
2. Einrichten einer Transplantation Apparat
Während die Embryonen entwickeln, die Einrichtung eines Transplantation Gerät durch den Anschluss der Transplantation Nadel auf die Mineralöl gefüllten Mikro-Pumpen-System. Stellen Sie sicher, dass das System nicht auslaufen und keine Luftblasen im System gefangen. Zurück füllen den gesamten Transplantation Nadel mit Mineralöl, mit Ausnahme der 0,5 bis 1 pl Platz an der Spitze öffnen.
3. Die Transplantation von Blastomeren
Um Transplantation Blastomeren, verwenden Sie ein Glas Positionierung Sonde in die Blastomeren Seite des 3-4-hpf Embryonen nach oben zu orientieren. Dann schieben Sie die Nadel in die Transplantation eines Spenders Embryo und langsam aufsaugen 5-20 Blastomeren in die Nadel. Legen Sie die Blastomeren gefüllte Nadel in eine Host-Embryo und lassen Sie die Blastomeren langsam. Der Ort, an dem die Blastomeren freigesetzt werden, beeinflussen, wo ihre Nachkommen in späteren Entwicklungsstadien zu lokalisieren. Um Netzhaut und der Entwicklung des Gehirns, Release-Zellen am animalen Pole zu analysieren. Während der Transplantation, stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze nicht in Kontakt mit Luft. Zur Minimierung von mechanischen Schäden tragen die Aufnahmestaaten Embryonen in die Agarose Brunnen bei 28,5 ° C bis zum nächsten Tag verlassen. Dann, transfer das Mosaik Embryonen bis 24-Well-Platten vorbeschichtet mit 0,5 ml 1% Agarose mit einem Embryo in jede Vertiefung. 1 ml der E3 Ei Wasser in jede Vertiefung gegeben. Um zu verhindern, bakterielle Infektionen, fügen Sie 10 ul 100X Penicillin und Streptomycin auf die E3 Ei Wasser.
Tag 3. Embedding und Live-Darstellung von Mosaik Embryonen
1. Embedding Embryonen
Bereiten Sie 1,5% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (LMP) in E3 Ei Wasser und halten Sie die Lösung in einem 30 ° C Wasserbad. Transfer-Mosaik Embryo zu einem FluoroDish Gewebe Kulturschale mit einem Glasboden der 0,17 mm in der Dicke (World Precision Instruments). Entfernen Sie überschüssiges Wasser E3 auf den Embryo nur durch eine minimale Menge an E3 bedeckt verlassen. Add 30-50 ul geschmolzen 1,5% LMP auf den Embryo. Schnell Position des Auges oder des Gehirns zu den Glasboden nah wie möglich vor dem Agarose-Lösung erstarrt. Nachdem die Lösung abgekühlt ist, fügen Sie zusätzliche Agarose-Lösung zur weiteren Sicherung der Embryonen statt. Dann tauchen die erstarrte Agarose-Block mit 2-3 ml E3 Ei Wasser.
2. Konfokale Bildgebung
Für die konfokale Mikroskopie, ist eine Wasser-Immersions-invertierten Ziel (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japan) mit großer Tiefenschärfe verwendet. Ein Tropfen Wasser auf die objektive hinzugefügt und dann einen FluoroDish Gewebekulturschale auf das Ziel. Um Bild-Entwicklung, Durchführung Zeitraffer-Bildgebung durch Fotografieren der Embryonen alle 5 Minuten. Je nach Art von Experimenten sollte die Zeitintervalle zwischen den Aufnahmen eingestellt werden.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt eine repräsentative 24-hpf Mosaik Zebrafisch. GFP-Expression Highlights der Spenderzellen in grün. Die Netzhaut Neuroepithelzellen deckt dabei die gesamte Dicke der Netzhaut Wand.
Der Film zeigt die Bewegungen der Spenderzellen in den Host Gehirn bei 24 hpf. Unsere Zellen Morphologien Laufe der Zeit ändern.
Abbildung 1. Shapes der Transplantation Nadelspitzen. A. Die abgeschrägte Öffnung der Spitze einer Nadel war frei von Schmutz nach Flusssäure wäscht. B. Ein spitzes Ende war an der Nadelspitze erzeugt.
Abbildung 2. Visualisierung von GFP-exprimierenden Spenderzellen in einem chimären Zebrafischembryonen bei 24 hpf. Die linke Tafel zeigt die GFP-Signale im Gehirn und Netzhaut. Das mittlere Feld ist ein helles Feld Bild des Embryos. Das rechte Bild zeigt das zusammengefügte Bild.
Movie 1. Live Darstellung von GFP positive Spenderzellen zeigten die umfangreichen Änderungen in der Morphologie des Gehirns Neuroepithelzellen während der Entwicklung. Die Einzelbilder des Films wurden alle 5 Minuten zwischen 24 und 25 hpf gesammelt. Klicken Sie hier um den Film zu sehen .
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Discussion
In diesem Video zeigen wir eine Methode zur Blastomere Transplantation der Retina und die Entwicklung des Gehirns beim Zebrafisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Geweben und Organen durch einfaches Loslassen der Spender Blastomeren zu entsprechenden Stellen in den Host-Embryonen zu analysieren. Die Markierung mit GFP-Moleküle führt zu einem saubereren Hintergrund als Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Dextran (Ho und Kane 1990). Dies liegt daran, die Trümmer des Dextran Farbstoffe aus toten Spender-Zellen dauert viel länger als GFP, so folgern mit Bildgebung (Catalano et al., 2007). Darüber hinaus sind die GFP-positiven Spenderzellen gesünder als solche mit Dextran Farbstoffe.
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Acknowledgments
NIH Grant R01EY016099 und Forschung zur Erblindung Career Development Award Prevent: Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) und die folgenden Mittel zur XW unterstützt. Wir bedanken uns bei Kira Lathrop um Hilfe bei der konfokalen Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
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References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
