Summary

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Published: July 19, 2010
doi:

Summary

Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.

Abstract

Hücreler embriyogenez sırasında konumlarını ve mal yaygın olarak değişir. Bu değişiklikler hücre ve çevreleri arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenir. Farklı genetik arka plan hücreleri oluşur Kimerik embriyolar, genler tarafından ilgi aracılı hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Erken gelişim aşamasında zebrafish embriyonik şeffaflık, hücresel düzeyde, doku ve organların morfolojilerinden doğrudan görselleştirme izin verir. Burada, zebrafish embriyolar kimerik retina ve beyin oluşturmak ve donör hücreleri canlı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Protokol nakli iğneler, nakli hazırlık kapsar GFP ifade GFP-negatif ana donör blastomer ve canlı konfokal mikroskobu altında donör hücre davranışlarının incelenmesi. Hafif değişiklikler, bu protokolü de embriyonik gelişim zebrafish diğer doku ve organları incelemek için kullanılan olabilir. Etiket donör hücreleri GFP kullanmanın avantajları da tartışılır.

Protocol

1. Gün. Hazırlık 1. Balık haçlar Akşam zebrafish ikili haç ayarlayın. Istenilen süre önce rastgele çiftleşme önlemek için, kadın ve erkek balık çiftleşme kasetleri ayrı bölücüler kullanın. GFP ifade transgenik balık donör blastomer kaynağı olarak kullanılır. Pt104 transgenik hattı (Zou ve ark, 2008), burada kullanılan EF1 promotör kontrolü altında yayg GFP ifade eder. GFP ifade donör hücreleri canlı görüntüleme görsell…

Discussion

Bu video, blastomer nakli zebrafish retina ve beyin gelişimini analiz etmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu protokol aynı zamanda ilgili yerlere sadece ev sahibi embriyolar donör blastomer bırakmadan diğer doku ve organların gelişimini analiz etmek için kullanılabilir. GFP molekülleri ile etiketleme, floresan boya konjuge Dextran'ın (Ho ve Kane 1990) ile etiketleme daha temiz bir arka plan verir. Bu ölü donör hücreleri Dextran'ın boyaların enkaz böylece görüntüleme (Catalano ve…

Acknowledgements

Erişmiş R01EY016099 ve Araştırma Körlük Kariyer Geliştirme Ödülü Engellenir: Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Çekirdek Grant (5P30EY008098) ve aşağıdaki fonlar XW tarafından desteklenmiştir. Kira Lathrop konfokal görüntüleme yardım için teşekkür ederim.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
5 ¾” Glass pipette   Fisher Scientific 13-678-30  
Borosilicate Glass Capillary   WPI (World Precision Instruments, Inc.) 1B100F-4  
FluoroDish   WPI FD35  
Vertical Needle / pipette Puller   David Kopf Instruments Model 720  
Micro Grinder   Marishige EG-400  
Micro Forge   Marishige MF-830  
Manual Microsyringe Pump   WPI MMP  
Forceps   Fine Science Tools 11232-20  
Hydrofluoric Acid   Fisher Scientific A147-1  
Penicillin- Streptomycin   GIBCO 15140-122  
Agarose   RPI (Research Products International Corp.) 9012-36-6  
Low melting agarose   Fisher Scientific BP165-25  

E3 egg water:

  • 5 mM NaCl
  • 0.17 mM KCl
  • 0.33 mM CaCl2
  • 0.33 mM MgSO4
  • 0.1% methylene blue

References

  1. Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
  2. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
  3. Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
  4. Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).

Play Video

Cite This Article
Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (41), e1924, doi:10.3791/1924 (2010).

View Video