でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em
Summary
アニマルキャップを過剰発現する遺伝子産物（s）を開発の側面に移植されています<em>アフリカツメガエル</em>胚組織が決定されているかどうかを確立するため。
Abstract
多くのタンパク質は、胚発生における二重の役割を果たす。特定の組織の細胞の運命決定を制御するものも、胚の大きな領域の発展に影響を与える可能性があります。これは解析が困難、特定の組織にその役割を定義することができます。例えば、<em>頭</emの>過剰発現<em>アフリカツメガエル</em>胚では眼を含めて、全体の前方領域の拡大を引き起こす<sup> 1,2</sup>。この結果から、ノギンは、神経組織の拡大を引き起こすことによって眼の決定またはその直接的な役割を果たしている場合、ノギンは間接的に目の形成に影響を与える知られていない。この複雑な表現型を持つことは、分析することは困難細胞の運命決定における眼特異的な役割を研究することができます。我々はこの問題を克服するアッセイを開発した。の多能性の性質を活用して<em>アフリカツメガエル</em>アニマルキャップ<sup> 3</sup>、我々は同じように、遺伝子産物の機能（複数可）をテストするためのアッセイを開発した<em>頭</em胚の側にこの組織を移植することにより、特定の組織または細胞型にキャップを変換する>または目のフィールドの転写因子（EFTFs）、<sup> 4</sup>。我々は、ノギン蛋白質の治療や転写因子のコレクションのいずれかを発見した一方で、動物のキャップで網膜細胞の運命を決定することができます、この手順は同様に他の組織を指定することに関与する遺伝子産物を同定するために使用することができます。
Protocol
Discussion
このビデオでは、我々はアニマルキャップの移植アッセイを作成するために再配置アフリカツメガエルの生物学者によって使用される古典的なテクニック、私たちのバージョンを示している。室温では、 アフリカツメガエルの胚では、ステージ9と15を介して非常に迅速に開発する。 14 ° Cでそれらを置くことによって、胚の発達が遅くなると、より多くの移植が一つの実験で行?…
Acknowledgements
この作品は、視覚障害（キャリア開発のMEZとASVの受賞と眼科への無制限の助成金）、E.マチルダゼイグラー財団（MEZとASV）と国立眼研究所/ NIH（MEZを防止するための研究からの補助金によって支えられて、助成金R01EY015748とR01EY017964）。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems/Ambion | AM1340 | ||
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc | 27-30-1 | ||
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instruments, Inc. | P-97 | ||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher | BW17-528Z | ||
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher | NC9644388 | ||
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | ||
| human chorionic gonadotropin | Intervet | 22219 | ||
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | ||
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher | 11-680-21 | ||
| Transfer pipette | Krackeler | 6290-20635A | ||
| Dumostar #5 Forceps | Fisher | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
